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Jun 27, 2023

Synthèse de l'ester phényléthylique de l'acide salicylique (SAPE) et son implication dans les rôles immunomodulateurs et anticancéreux

Rapports scientifiques volume 12,

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 8735 (2022) Citer cet article

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L'ester phényléthylique de l'acide salicylique (SAPE) a été synthétisé par estérification sélective catalysée par Zn(OTf)2 de l'acide salicylique et de l'alcool phényléthylique et étudié pour son rôle d'agent immunomodulateur et anticancéreux. Une faible toxicité et des propriétés physiques, de type Lipinski et de solubilité favorables ont été élucidées par des études ADME-tox. L'amarrage moléculaire de SAPE contre COX-2 a révélé un score MolDock, un score de reclassement, une énergie d'interaction, une énergie de pose interne et une liaison hydrogène favorables par rapport à l'ibuprofène et à l'indométhacine. Une RMSD moyenne d'environ 0, 13 nm pour le complexe amarré avec une condition d'équilibre dynamique stable a été notée au cours de la simulation MD de 20 ns. Une faible bande interdite prédisant une forte affinité de liaison au site actif de l'enzyme a été prédite en outre par l'analyse DFT. L'ester a provoqué une réduction du pourcentage d'hémolyse des érythrocytes et s'est avéré non cytotoxique contre les lymphocytes humains, CaCo-2 et les cellules HepG-2 par le test MTT. De plus, son efficacité in vitro dans l'inhibition de l'enzyme COX-2 dans les cellules intestinales stimulées par le LPS et les tests de séquestration directe s'est avérée supérieure à celle de l'acide salicylique et de l'indométhacine. L'activité anticancéreuse de SAPE a été testée sur la lignée cellulaire de cancer du sein MCF-7, et une efficacité potentielle a été démontrée en termes de diminution de la viabilité cellulaire. L'analyse par cytométrie en flux a montré l'arrêt du cycle cellulaire aux phases G1/G0 et S, au cours desquelles l'induction de la formation de vésicules autophagiques et la diminution du potentiel de membrane mitochondriale ont été observées en raison de l'augmentation de la production de ROS. De plus, à ces phases, le début de l'apoptose ainsi que des dommages à l'ADN ont également été observés. Le prétraitement avec SAPE chez les rats Wistar induits par la colite a affiché un faible indice d'activité de la maladie et une réduction de l'étendue de la perturbation des tissus intestinaux et de la peroxydation lipidique. Une augmentation marquée des enzymes anti-oxydantes, à savoir la catalase, la GGT et la GST, et une diminution des cytokines pro-inflammatoires IL-6 et TNF-α dans les extraits de tissus intestinaux des groupes traités ont été notées. Les résultats de cette étude ont une crédibilité suffisante pour soutenir que l'ester synthétisé (SAPE) soit considéré comme un composé anti-oxydant et anti-inflammatoire avec un potentiel thérapeutique pour la gestion efficace du cancer.

Les esters phénoliques sont partiellement solubles dans l'eau et présentent des propriétés antioxydantes et se trouvent en abondance dans les produits naturels1. Ils possèdent une variété d'activités pharmacologiques telles que des effets anti-inflammatoires, antioxydants, immunomodulateurs et anticancéreux, par exemple, le phénéthylester d'acide caféique (CAPE), un composant actif phénolique de la propolis d'abeille2. Ces composés sont structurellement non sophistiqués; cependant, leur synthèse est généralement compliquée en raison de la charge de groupes protecteurs pour une chimiosélectivité améliorée, ou de l'utilisation de conditions difficiles ou de l'utilisation excessive de l'un des réactifs3,4. Les rendements d'estérification sont liés à la distribution électronique des acides phénoliques qui affectent la réactivité de la fonction carboxylique ainsi que la longueur de chaîne carbonée des alcools1. L'estérification de la fonction acide carboxylique a montré des activités anti-inflammatoires plus élevées avec un effet ulcérogène réduit par rapport aux composés standard5. De plus, l'estérification de l'acide acétylsalicylique, de l'acide salicylique, de l'acide flufénamique, de la tolmétine et de divers autres acides anti-inflammatoires non stéroïdiens entraîne la production d'esters méthyliques avec une activité ulcérogène gastrique plus faible6.

L'acide salicylique est un composé phénolique pharmacologiquement actif et se trouve dans diverses plantes. Son mode d'action comprend l'inhibition de la synthèse des prostaglandines et la suppression de la transcription des gènes de la cyclooxygénase7. Des maladies vasculaires cérébrales anti-cardio et des activités anticancéreuses de l'acide salicylique sont signalées8. L'acide acétylsalicylique, dérivé de l'acide salicylique, est l'un des anti-inflammatoires les plus utilisés au monde et induit une activité anticancéreuse57. Rigas et Kozoni10 ont synthétisé un nouveau dérivé phénylester de l'aspirine et ce composé a inhibé la croissance des cellules humaines d'adénocarcinome du côlon (HT-29) grâce à une combinaison d'effets antiprolifératifs et proapoptotiques. Çalışkan et al.11 ont également synthétisé une série de nouveaux dérivés d'acide 1-benzyl-5(3)-p-tolyl-1H-pyrazole-3(5)-carboxylique et ont découvert que certains de ces composés présentaient des activités analgésiques et anti-inflammatoires. . Récemment, Liu et al.12 ont synthétisé un nouveau dérivé par la réaction de l'acide salicylique avec l'α-aminophosphonate et ont démontré que le dérivé d'acide salicylique synthétisé avait une activité inhibitrice contre les lignées cellulaires de cancer du foie et du col de l'utérus.

L'acide salicylique est très sensible à l'oxydation, car son hydroxylation par les hydroxylases microsomales hépatiques forme l'acide gentisique, qui peut réagir davantage pour produire d'autres dérivés hydroxylés par attaque HO. Cependant, les dérivés de salicylate oxydés possèdent une activité antioxydante accrue, en partie en raison de leur capacité à fonctionner comme donneurs d'électrons ou d'atomes d'hydrogène13. Ces dérivés phénoliques ont une faible toxicité aiguë et le second groupe OH en position ortho ou para augmente l'activité antioxydante. De plus, l'activité des monophénols augmente considérablement avec un ou deux substituants méthoxyliques14. Les esters d'acide salicylique ont un large spectre d'activités biologiques, et l'estérification de l'acide salicylique avec du méthanol a été réalisée à l'aide de différents catalyseurs comme les résines échangeuses de cations modifiées Ce4+15 et les oxydes métalliques modifiés anioniques comme la zircone, l'alumine et la silice16.

Nos études précédentes avec de la bière de riz (un produit fermenté traditionnel d'Assam, en Inde), ont révélé la présence d'une quantité considérable d'acide salicylique dans les plantes de départ17 et de 2-phényléthanol (PEA) dans le produit final18. Le PEA est un alcool aromatique présent dans les aliments fermentés et diverses souches de levure le produisent à partir de la L-phénylalanine via la voie d'Ehrlich impliquant trois enzymes19. Comme aucun rapport n'était disponible sur l'estérification de l'acide salicylique avec de l'alcool phényléthylique en utilisant du trifluorométhanesulfonate de zinc [Zn(OTf)2] comme catalyseur, par conséquent, pour la première fois, l'ester phényléthylique de l'acide salicylique (SAPE) a été synthétisé par Zn(OTf)2-catalysé estérification sélective. L'ester synthétisé a ensuite été testé pour son rôle immunomodulateur en tant qu'agent antioxydant, anti-inflammatoire et anticancéreux via des approches in silico, in vitro et in vivo.

La réaction de production de SAPE est illustrée sur la figure SF1. Le mélange 40:60 acétate d'éthyle:hexane a donné les meilleurs résultats en termes de concentration en composé. Les tracés RMN 13C et RMN 1H de la molécule SAPE synthétisée sont représentés sur les Fig. SF2 et SF3, respectivement. Le tracé FTIR de la molécule SAPE synthétisée est illustré à la Fig. SF4. Les données obtenues sont les suivantes : 13C (ppm) : 3409, 65,8, 112,1, 118,1, 119,2, 126,12, 129,0, 130,1, 131,1, 135,2, 138,1, 161,8, 170,1. FTIR (cm−1) : 501, 672, 750, 1070, 1110, 1220, 1292, 1480, 1683, 3150. 1H (ppm) : 3,1 (t,2H), 4,52 (t,2H), 6,7–6,98 ( m,2H), 7,1–7,48 (m,5H), 7,7–7,8 (m,2H), 10,7 (s,1H).

Les propriétés de toxicité ADME sont directement liées à l'effet biologique des médicaments et à leur devenir dans un organisme, et les méthodes in silico peuvent prédire ces propriétés à un stade précoce de la conception des médicaments20. La solubilité, le volume de distribution, l'absorption, le transport de la barrière hémato-encéphalique, la biodisponibilité, les effets sur la santé et les valeurs LD50 de la molécule SAPE, tels que prédits par ACD/Labs I-Lab 2.0, sont présentés dans le tableau ST1. La solubilité (LogSw) s'est avérée être de -4,03, tandis que l'absorption (LogP) était de 4,15, le transport de la barrière hémato-encéphalique (LogP) était de 4,15 et le volume de distribution était de 0,44 L/kg. L'absorption passive maximale était de 100 % par voie transcellulaire, tandis que la perméabilité dans le jéjunum humain était de 7,51 × 10−4 cms−1. La probabilité que le composé ait une biodisponibilité de % F (oral) > 30 % était de 0,811 et une biodisponibilité de % F (oral) > 70 % était de 0,358, alors que la probabilité d'effet sur le sang était de 0,39 ; système cardiovasculaire 0,5 ; système gastro-intestinal 0,6, rein 0,26, foie 0,14 et poumons était de 0,19. Les valeurs LD50 pour le rat se sont avérées être de 570 mg/kg (administré par voie intrapéritonéale) et de 2500 mg/kg (administré par voie orale). L'activité CNS de SAPE est également représentée sur la figure SF5. Les propriétés physicochimiques prévues de SAPE, à savoir la réfraction molaire, le volume molaire, le parachor, l'indice de réfraction, la tension superficielle, la densité et la polarisabilité et les propriétés liées à la spectrométrie de masse de SAPE, sont présentées dans le tableau ST4. De plus, les propriétés de type Lipinski ont également été déduites et se sont révélées favorables (tableau ST2).

Initialement, la prédiction du site de liaison potentiel du ligand (site actif) sur COX-2 affichait un volume de cavité de 56,32 Å3, une surface de cavité de 175,36 Å2 et positionné à X : 13,44 ; Y : 24,14 ; Z : 24,58 avec un rayon de site de liaison de 15 Å (Fig. SF6), et une simulation d'amarrage moléculaire a été réalisée contre SAPE, l'ibuprofène et l'indométhacine. La fonction de notation basée sur une grille, MolDock Score [GRID] a été utilisée pour évaluer les solutions d'amarrage. Étant donné que les composés étudiés possédaient plusieurs degrés de liberté internes, MolDock SE a été utilisé comme algorithme de recherche alternatif21. Les poses supérieures qui se sont amarrées au site actif de COX-2 sont illustrées à la Fig. 1 [i] A, B, C, D, E et F, et les valeurs ont été classées en fonction du score de reclassement (tableau 1).

[i] (A) Interactions protéine-ligand entre SAPE et les résidus du site actif de l'enzyme COX-2 (B) Mode de liaison de la SAPE au niveau des résidus du site actif de l'enzyme COX-2 (C) Interactions protéine-ligand entre l'ibuprofène et le site actif résidus de l'enzyme COX-2 (D) Mode de liaison de l'ibuprofène au niveau du site actif résidus de l'enzyme COX-2 (E) Interactions protéine-ligand entre l'indométhacine et les résidus du site actif de l'enzyme COX-2 (F) Mode de liaison de l'indométhacine au niveau du résidus du site actif de l'enzyme COX-2. [ii] Simulation MD montrant le tracé RMSD du complexe ligand protéique ancré montrant que SAPE-COX-2 est plus stable que le complexe ibuprofène et indométhacine. [iii] (a) Orbitale moléculaire représentant le HOMO (E = -6,29 eV) de SAPE calculé au niveau théorique DFT/B3LYP/6-31G. ( b ) Orbitale moléculaire représentant le LUMO (E = -1, 09 eV) de SAPE calculé au niveau théorique DFT / B3LYP / 6-31G.

Les scores d'amarrage moléculaire (tableau 1) ont révélé que la SAPE pouvait être ancrée au site actif de la protéine COX-2 avec les scores d'amarrage favorables ; ce qui indique que l'enzyme favorise généralement la SAPE par rapport à l'ibuprofène et à l'indométhacine. Dans le moteur d'amarrage moléculaire, SAPE, l'ibuprofène et l'indométhacine ont été classés parmi les cinq premiers succès d'amarrage sur la base du score MolDock, du score Rerank et de l'énergie d'interaction. Le score MolDock utilisé dans la présente enquête est dérivé des fonctions de notation PLP initialement proposées par Gehlhaar et al.22, puis étendues par Yang et al.23. La fonction de notation d'amarrage, Escore, est définie comme suit : EScore = Einter + Eintra, où Einter est l'énergie d'interaction ligand-protéine et Eintra est l'énergie interne du ligand. Alors que le score Rerank est une combinaison linéaire de E-inter (stérique, Van der Waals, liaison hydrogène et électrostatique) entre le ligand et la protéine, et E-intra (torsion, sp2-sp2, liaison hydrogène, Van der Waals et électrostatique). électrostatique) du ligand pondéré par les coefficients prédéfinis.

Afin d'examiner l'interaction moléculaire, l'analyse de l'interaction ligand-protéine pour les coups d'amarrage SAPE, l'ibuprofène et l'indométhacine à l'aide du MVD Ligand Energy Inspector a été évaluée, et le tableau 2 montre les détails des interactions moléculaires des coups d'amarrage. L'interaction ligand-protéine, y compris l'interaction des résidus et leurs distances d'interaction, a été déterminée, la SAPE ayant montré une interaction moléculaire avec Leu353(O) et Tyr356(OH) (Fig. 1A et B), l'ibuprofène avec Arg121(NH2) et Tyr356(OH) (Fig. 1C et D) tandis que l'indométhacine avec Arg514(NH) et His90(NE) (Fig. 1E et F). La carte d'énergie et l'interaction électrostatique des coups d'amarrage sont illustrées sur les Fig. SF7A et B, SF8A et B et Fig. SF9A et B. La carte énergétique de l'enzyme contribuant à l'interaction stérique favorable (couleur verte), accepteur d'hydrogène favorable (couleur turquoise) et donneur d'hydrogène favorable (couleur jaune) et interaction électrostatique de les composés ancrés soutiennent également l'interaction moléculaire favorable.

La simulation MD a été réalisée uniquement pour le docking hit (complexes ancrés SAPE-COX-2, ibuprofène-COX-2 et indométhacine-COX-2). Les données RMSD pour les complexes amarrés au ligand protéique ont été tracées et présentées sur la figure 1 [ii]. Le squelette RMSD des simulations MD de 20 ns pour comprendre les changements conformationnels du complexe de liaison protéine-ligand et de la protéine se produisant dans l'environnement dynamique a été élaboré. Le graphique RMSD explique clairement les variations de la protéine COX-2 et des complexes de liaison protéine-ligand. La RMSD moyenne a montré ~ 0,13 nm pour le complexe ancré SAPE-COX-2. Alors que la protéine a montré un écart moyen de RMSD d'environ 0, 23 nm, révélant une condition d'équilibre dynamique plus stable du complexe protéine-ligand. Cela confirme la stabilité conformationnelle du complexe amarré et simulé pendant la simulation de 20 ns.

Les énergies HOMO et LUMO de SAPE sont illustrées sur la Fig. 1 [iii] A et B, respectivement. Ces énergies aident à comprendre l'énergie de la bande interdite de la pose ancrée. Un écart d'énergie de bande faible indique une réactivité plus élevée et donc le composé est considéré comme suffisamment fort pour se lier au site actif de la protéine. L'énergie de la bande interdite (ΔELUMO-HOMO) était de - 5, 12 eV, ce qui confirme une faible bande interdite et aura certainement une forte affinité de liaison au site actif de l'enzyme cible. La carte de contour pour représenter le potentiel électrostatique de SAPE et le spectre IR prédit de SAPE ont également été calculés au niveau de la théorie DFT/B3LYP/6-31G et ceux-ci sont représentés dans les Fig. SF10 et SF11 supplémentaires, respectivement.

Les résultats du test de stabilité membranaire en termes de pourcentage d'hémolyse sont présentés sur la figure 2A. Il s'est avéré être de 0,0704 % dans le cas du témoin négatif PBS et de 100 % dans le cas du témoin positif Triton X-100. Considérant que, dans le cas de SAPE, il s'est avéré être de 58,08 % pour 25 µg/mL, et différait significativement à P ≤ 0,01 avec le contrôle positif ; et 56,28 % et 54,88 % pour 50 µg/mL et 100 µg/mL, différaient également significativement (P ≤ 0,001) avec le témoin positif. Ainsi, il a été observé que jusqu'à 200 ug/mL, la fonctionnalisation de surface de la SAPE conférait une stabilité aux globules rouges et prévenait considérablement l'hémolyse. Il a également été observé que la stabilité de la membrane augmentait avec l'augmentation de la concentration de SAPE. Le Triton X-100 est généralement utilisé pour lyser les cellules ou pour perméabiliser les membranes des cellules vivantes. Il a été observé qu'en présence de SAPE, le Triton X-100 présentait significativement moins d'hémolyse que les échantillons vierges.

(A) Test de stabilité membranaire de SAPE dans les érythrocytes et (B), (C) et (D) Résultats du test de viabilité cellulaire de SAPE à 48 h sur des cellules de (A) PBMC, (B) Caco2 et (C) HepG2 avec des doses de (25, 50 et 100 µg/ml) ou avec 0,1 % de DMSO comme véhicule témoin mesuré par la méthode basée sur le MTT. Les graphiques ont été présentés en termes de pourcentage moyen ± SEM de cellules mortes vivantes des trois ensembles indépendants. Les données représentées sous forme de moyenne ± SEM Les valeurs étaient significatives à ***P ≤ 0,001, **P ≤ 0,01 et *P ≤ 0,05 par rapport au contrôle.

Les résultats du test MTT de SAPE sur PBMC, des lignées cellulaires intestinales humaines dérivées du carcinome du côlon (CaCo-2) et des lignées cellulaires du cancer du foie (HepG-2) sont présentés sur les figures 2B – D respectivement. Alors qu'aucune différence significative (P ≤ 0,05) dans la viabilité cellulaire n'a été observée dans le cas des PBMC, les résultats de l'essai avec des cellules CaCo-2 ont révélé que le pourcentage de cellules viables augmentait avec l'augmentation de la concentration de SAPE. Il n'y a eu aucun changement significatif dans le nombre de cellules viables après traitement avec 25, 50 et 100 µg/mL de SAPE, par rapport au témoin. Cependant, à 200 µg/mL de SAPE, une différence significative (P ≤ 0,05) a été observée. Étant donné que les cellules CaCo-2 expriment plusieurs caractéristiques morphologiques et fonctionnelles des entérocytes absorbants matures avec une couche de bordure en brosse que l'on trouve dans l'intestin grêle, et les résultats corroborent la sécurité de l'absorption cellulaire de SAPE. HepG-2 exprime la plupart des enzymes métabolisant les médicaments26, et dans le test avec HepG-2, il a été observé que même si le pourcentage de cellules viables diminuait avec l'augmentation des concentrations de SAPE, il n'y avait pas de changement significatif (P ≤ 0,05) dans le nombre de cellules viables après traitement avec différentes concentrations de SAPE, par rapport au témoin.

La COX-2 est une isoforme inductible de la cyclooxygénase qui est principalement produite dans les tissus enflammés et effectivement absente dans les tissus sains. Elle est induite dans les cellules migratrices et autres par des agents pro-inflammatoires tels que les endotoxines, les mitogènes et les cytokines dans des conditions pathologiques 27. De nombreux effets anti-inflammatoires, antipyrétiques, analgésiques et antithrombotiques sont attribués à l'inhibition de l'activité COX-2 par les AINS. Dans le test cellulaire CaCo-2 stimulé par LPS, le pourcentage d'inhibition de la production de COX-2 a été calculé en considérant les cellules stimulées non traitées comme contrôle et les résultats sont présentés sur la figure 3A. Il a été observé que l'alcool phényléthylique seul ne possédait aucune activité inhibitrice de la COX-2. L'ester a montré une meilleure inhibition de la COX-2 à toutes les concentrations étudiées (25, 50 et 100 µg/ml) que l'acide salicylique. De plus, à ces concentrations, son activité inhibitrice de la COX-2 était comparable à celle de l'indométhacine. Dans le test d'inhibition directe, il a également été observé que l'activité de SAPE était plus élevée (Fig. 3B). A une concentration de 100 ug/ml, le pourcentage d'inhibition relative (79,42%) qui a été obtenu par SAPE était supérieur à la fois à l'acide salicylique (68,13%) et à l'indométhacine (65,69%). De plus, la faible valeur IC50 de SAPE (9,37 µg/ml) par rapport à l'acide salicylique (58,84 µg/ml) et à l'indométhacine (12,69 µg/ml) est une indication claire de l'efficacité à haute dose de l'ester dans des conditions in vitro.

(A) L'inhibition de la production de COX-2 dans les cellules CaCo-2 enflammées, et (B) l'inhibition relative directe de la COX-2 par l'alcool phényléthylique (PEA), l'acide salicylique (SA), l'ester phényléthylique de l'acide salicylique (SAPE ) et l'indométhacine (IM).

D'après les résultats, il devient évident que l'estérification de l'acide salicylique augmente considérablement l'activité anti-inflammatoire de l'acide salicylique et ces résultats corroborent les découvertes précédentes5,13,14. Les résultats sont énormes car les composés qui inhibent l'activité de la COX-2 trouvent leur importance à la fois dans le traitement des réponses inflammatoires et dans le maintien de la santé et du bien-être humains. En effet, l'expression aberrante de la COX-2 a été largement impliquée dans la pathogenèse de nombreux types de cancers comme le cancer colorectal et ses niveaux élevés ont été associés à une diminution du taux de survie des patients atteints de cancer28.

Pour déterminer l'effet cytotoxique de SAPE sur les cellules MCF-7, un test de viabilité cellulaire a été effectué à l'aide des méthodes d'exclusion du colorant MTT (Fig. 4a) et du colorant bleu trypan (Fig. 4b). Les cellules traitées avec différentes doses (25, 50 et 100 µg/mL) de SAPE ont été évaluées pour son effet sur le nombre de cellules vivantes et mortes, qui a été calculé au bout de 48 h. Il a été observé que la diminution du nombre total de cellules s'accompagne d'une augmentation significative de la mort cellulaire. Les résultats ont clairement démontré que la SAPE pouvait inhiber de manière significative la viabilité des cellules MCF-7 à croissance exponentielle avec une concentration croissante, alors qu'en même temps, elle n'avait aucun effet prononcé sur les cellules normales, comme en témoigne l'étude avec des PBMC humains, des cellules Caco2 et HepG2. , suggérant ainsi que l'effet de SAPE était sélectif pour les cellules cancéreuses.

( a ) Résultats du test de viabilité cellulaire de SAPE sur des cellules MCF-7 mesurés par la méthode basée sur le MTT. (b) Test de viabilité cellulaire de SAPE à 48 h sur des cellules de MCF-7 avec des doses de (25, 50 et 100 µg/mL) ou avec 0,1 % de DMSO comme véhicule témoin en utilisant la méthode d'exclusion du bleu trypan. Les graphiques sont présentés en termes de pourcentage moyen ± SEM de cellules vivantes et mortes des trois ensembles indépendants. Les valeurs étaient significatives à *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 et ***P ≤ 0,001 par rapport au contrôle.

La lignée cellulaire MCF-7 est un carcinome du sein humain de sous-type ER-positif et luminal29. On a vu que le traitement des cellules MCF-7 avec SAPE a tendance à modifier la distribution des différentes phases du cycle cellulaire. Comme le montre la figure 5A, le traitement avec SAPE a entraîné une diminution du pourcentage de cellules dans les phases G0/G1 et S, par rapport aux cellules non traitées. Cela indique que la SAPE entraîne l'induction de l'apoptose, puisque les cellules sous-G1 sont en fait les cellules apoptotiques à faible teneur en ADN. Dans les phases G2/M ainsi que les phases apoptopiques, on a vu que le traitement par la SAPE provoque une augmentation significative du % de cellules. Ainsi, SAPE induit un arrêt G2/M proéminent dans les cellules MCF-7 de manière dose-dépendante (P ≤ 0,001). Cependant, lorsque la dose de SAPE a été augmentée jusqu'à 100 µg/mL, nous avons constaté une diminution significative du pourcentage de cellules en phase G1, néanmoins, davantage de cellules ont également été arrêtées en phase S ainsi qu'en phase apoptotique ( Fig. 5A) du cycle cellulaire. Ces résultats suggèrent l'inhibition de la croissance cellulaire conduisant à une augmentation du nombre de cellules entrant dans la phase G1, ce qui induit ensuite l'apoptose cellulaire.

(A) Analyse du cycle cellulaire de SAPE sur des cellules MCF-7 avec des doses de 25, 50, 100 µg/mL ou avec 0,1 % de DMSO comme témoin de véhicule pendant 48 h de distribution de phase du cycle cellulaire détectée dans un cytomètre en flux. Affichage de l'histogramme du contenu de l'ADN, à savoir. La fluorescence PI (axe des x) par rapport aux comptages (axe des y) et le diagramme à barres correspondant est la représentation de la distribution des phases du cycle cellulaire des phases G0/G1, S et G2/M. (B) L'effet de SAPE sur les niveaux de ROS intracellulaires dans les cellules MCF-7 à 48 h a été analysé par cytomètre en flux avec un colorant de fluorescence spécifique aux ROS (DCFDA). Les niveaux de ROS intracellulaires ont été représentés par histogramme et les changements de pli correspondants représentés par un graphique à barres ont été évalués par cytométrie en flux. (C) Effet de SAPE sur MMP dans des cellules MCF-7. Après cela, l'intensité de fluorescence de la rhodamine-123 a été mesurée par cytométrie en flux à 488 nm (excitation) et 525–530 nm (émission) et les données ont été représentées par un histogramme et les changements de pli correspondants représentés par un graphique à barres. Les données représentées sous forme de moyenne ± SEM Les valeurs étaient significatives à ***P ≤ 0,001, **P ≤ 0,01 et *P ≤ 0,05 par rapport au contrôle.

Le niveau de ROS dans les cellules a été analysé afin d'aborder le rôle joué par les ROS dans l'apoptose induite par SAPE. Il a été observé qu'à la fin des 48 h d'exposition à la SAPE, la génération de ROS était induite de manière significative, comme en témoigne l'augmentation de l'intensité de fluorescence (Fig. 5B). En comparaison avec les cellules non traitées, nous avons constaté que SAPE provoquait une augmentation du nombre de cellules positives pour les ROS, ainsi que de l'intensité de fluorescence moyenne (MFI) à 1,30 fois (P ≤ 0,001) pour MCF-7, comme le montre la figure 5B. Les ROS sont principalement produites dans les mitochondries et une gradation vers le haut du niveau de ROS pourrait déclencher des événements initiés par les mitochondries conduisant à l'apoptose. De plus, la production de ROS pourrait perturber l'homéostasie du système enzymatique des antioxydants responsables du piégeage des ROS. Les preuves suggèrent que l'accumulation de ROS pourrait être le résultat d'une augmentation du rapport de Bax et Bcl-2, ce qui diminue le MMP (comme cela sera évident dans la section "Analyse MMP"), et induira davantage la libération de cytochrome C58. Les résultats démontrent clairement que SAPE pourrait élever de manière significative le niveau de ROS dans les cellules MCF-7 et indique une fonction possible des ROS dans le processus d'apoptose.

La perte en MMP a été analysée, car une perte en Δψm est directement associée à une rupture d'équilibre entre les expressions des protéines pro- et anti-apoptotiques au sein de la famille Bcl-2. Une réduction de Δψm conduit à la libération de cytochrome C mitochondrial, entraînant ainsi la formation d'apoptosomes, ce qui entraîne finalement une apoptose médiée par les mitochondries30. La perte de ΔΨm s'est traduite par une diminution de l'intensité de la technique de coloration fluorescente à la rhodamine-123, qui a été utilisée pour détecter l'intégrité de la membrane mitochondriale ou la dépolarisation de la membrane mitochondriale. Les résultats de la présente enquête ont révélé que lors de l'exposition à la SAPE, il y avait une diminution significative du potentiel de la membrane mitochondriale par rapport au contrôle. Cela a été mis en évidence par le changement de l'intensité de fluorescence moyenne (MFI) qui a mis en évidence une multiplication par 1, 34 ( P ≤ 0, 001) avec les doses les plus élevées de SAPE à 48 h (Fig. 5C). Ces résultats ont clairement montré que la SAPE pourrait induire l'apoptose via les voies mitochondriales, ce qui pourrait constituer une nouvelle stratégie pour le traitement du cancer puisque les mitochondries sont l'une des principales voies de l'apoptose.

L'apoptose ou mort cellulaire programmée de type I est un mécanisme intégré du corps pour détruire les cellules qui représentent une menace pour l'intégrité physiologique d'un organisme. Il est activé par le déséquilibre entre les signaux pro-apoptotiques et anti-apoptotiques31. Le principal changement morphologique caractérisant l'apoptose est la formation de corps apoptotiques, couplée à un bourgeonnement membranaire, un rétrécissement cellulaire et une condensation de la chromatine30. Les résultats (Fig. 6A) ont montré que les cellules MCF-7 traitées avec SAPE à diverses doses présentaient un gradient de changement de couleur du vert-orange-rouge lorsqu'elles étaient colorées avec une double coloration AO/EtBr, signifiant l'effet de la concentration efficace à laquelle les cellules étaient exposées. avec, tandis que les cellules cancéreuses non traitées ont continué à devenir fluorescentes de couleur verte. Ainsi, il pourrait être interprété que l'augmentation de la concentration (25 et 100 g/mL) de SAPE de manière significative (P ≤ 0,001) induit des dommages aux cellules cancéreuses favorisant l'apoptose des cellules. Ces dommages nucléaires vont de l'apoptose précoce (trouvée à de faibles doses) à l'apoptose tardive ou à la nécrose à mesure que la dose augmente (Fig. 6A). Ainsi, l'induction de l'apoptose dans les cellules MCF-7 qui les rend plus sensibles à la phagocytose de l'hôte sans déclencher d'inflammation pourrait être attribuée à l'activité tumoricide de la SAPE.

(A) Images représentatives du test d'apoptose de SAPE sur MCF-7 avec différentes doses (25 et 100 µg/mL) ou avec 0,1 % de DMSO comme témoin de véhicule pendant 48 h, déterminées par coloration au colorant AO/EtBr ; (B) Images représentatives de la comète pour les dommages à l'ADN dans SAPE dans les cellules MCF-7 détectées par dosage de la comète neutre et quantification du pourcentage de cellules endommagées par l'ADN en mesurant (i) la zone de la comète et (ii) la longueur de la queue de la comète avec Ouvrez le logiciel Comet. Données représentées sous forme de moyenne ± SEM. Les valeurs étaient significatives à *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 et ***P ≤ 0,001 par rapport au contrôle.

L'accès à l'intégrité de l'ADN est un marqueur utile pour le criblage d'agents anticancéreux potentiels puisque le phénomène d'apoptose est exprimé par les cellules après avoir subi des dommages à l'ADN31. De plus, l'induction de dommages à l'ADN pourrait être un outil efficace pour le traitement du cancer. Les résultats du test de la comète neutre présentés à la Fig. 6B ont montré que les dommages à l'ADN dans les cellules MCF-7 exposées à trois concentrations différentes de 25 et 100 µg/mL de SAPE pendant 48 h se sont révélés significativement (P ≤ 0,001) génotoxiques pour les cellules respectives, comme noté par l'augmentation dépendante de la concentration de la fragmentation de l'ADN. Le test des comètes est une indication du niveau de dommages à l'ADN hétérogène dans les cellules individuelles, et les dommages à l'ADN dans les cellules MCF-7 démontrent en outre un facteur de réponse tumorale potentiel pour le composé32. Sur la base de ces observations, nous avons découvert que SAPE pouvait induire l'apoptose des cellules MCF-7. Les agents anticancéreux qui pourraient moduler l'apoptose sont capables d'affecter l'état d'équilibre des populations cellulaires, ce qui est efficace pour la gestion et le traitement du cancer. Par conséquent, la SAPE pourrait être supposée avoir une activité anticancéreuse contre les cellules MCF-7 via l'induction de l'apoptose.

L'autophagie ou mort cellulaire programmée de type II est un mécanisme catabolique conservé au cours de l'évolution de la mort cellulaire impliquant la dégradation de protéines ou d'organites endommagés. Il exerce un rôle protecteur qui permet aux cellules cancéreuses de survivre contre les agents cytotoxiques. Au cours de l'autophagie, les autophagosomes séquestrent les constituants cytoplasmiques et fusionnent ensuite avec les lysosomes pour former des autolysosomes, dans lesquels les organites engloutis sont dégradés29,30. Afin de déterminer si l'inhibition de l'autophagie améliorait l'apoptose induite par la SAPE dans les cellules MCF-7, l'analyse de l'autophagie a été effectuée. Il a été observé que l'exposition SAPE aux cellules MCF-7 provoque une augmentation significative à la fois du corps autophagique et des vésicules acides. Nous avons également visualisé l'effet du traitement SAPE sur la formation d'organites vésiculaires acides (AVO) dans les cellules MCF-7 pendant 48 h en utilisant la microscopie à fluorescence lors de la coloration avec l'agent lysosomotrope AO, comme le montre la figure 7A. Comme il est évident, le traitement des cellules MCF7 avec SAPE a entraîné la formation de vacuoles et de mitochondries condensées, la chromatine dispersée, la formation de corps apoptotiques, les vésicules autophagiques et le saignement membranaire. Les images obtenues par des études de fluorescence ont été traitées avec ImageJ pour évaluer le degré d'acidité ainsi que le nombre d'autophagosomes. Alors que les cellules non traitées avaient une morphologie nucléaire et cytoplasmique normale, il a été observé qu'il y avait une augmentation significative du degré d'acidité des cellules à des concentrations plus élevées (figure 7B). En outre, il a également été constaté que le nombre d'autophagosomes augmentait lors du traitement, ce qui pourrait être dû à une augmentation du degré d'acidité, ce qui reflète davantage le microenvironnement autophagique dans les cellules.

(A) Microscopie à fluorescence pour l'analyse des vésicules acides et des autophagosomes contre les cellules MCF-7 traitées par SAPE (B) Analyse du degré d'acidité contre les cellules MCF7 traitées par SAPE (25, 50, 100 µg/mL) pendant 48 h. (C) Analyse de la formation de vésicules autophagiques contre des cellules MCF7 traitées avec SAPE (25, 50, 100 µg/mL) pendant 48 h ; (D) L'intensité fluorescente moyenne de l'AO mesurée par cytométrie en flux à 488 nm (excitation) et 525–530 nm (émission). Données exprimées en (Moyenne ± SEM, n = 3). Les valeurs étaient significatives à *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 et ***P ≤ 0,001 par rapport au contrôle.

Pour l'analyse quantitative, nous avons quantifié la fluorescence AO par cytométrie en flux. La formation de vacuoles autophagiques a été mise en évidence par une intensité de fluorescence rouge accrue (Fig. 7C). Il a été observé qu'au bout de 48 h d'exposition par traitement SAPE, des vacuoles autophagiques étaient induites de manière significative, comme l'indique l'augmentation de l'intensité de fluorescence (Fig. 7D). En comparaison avec les cellules non traitées, nous avons constaté que les cellules traitées par SAPE avec une plage de dosage de 25 à 100 µg/mL provoquaient une augmentation du MFi des vacuoles autophagiques (1,48 fois à 50 µg/mL) dans les cellules positives, mais à 100 µg/mL, il diminuait le MFi à 0,613 fois comme pour 48 h. Comme le montrent d'autres études29,30, l'autophagie joue un rôle dans la régulation des réponses de survie dans les cellules de mélanome malin qui ont été ciblées à l'aide de différentes approches immunothérapeutiques, et donc ces résultats témoignent d'un rôle positif de SAPE en tant qu'agent anticancéreux contre les cellules MCF-7.

Les résultats obtenus pour le test du processus inflammatoire aigu par modèle d'œdème de la patte sont présentés dans le tableau 3. Une diminution du % d'œdème de la patte a été observée dans le groupe traité par SAPE dès la 1ère heure jusqu'à la 5ème heure. Cependant, une différence significative n'a été observée qu'à la 3ème, 4ème et 5ème heure après l'injection de carraghénane. Cette différence après la 3ème heure pourrait être révélatrice de l'action de la SAPE qui implique l'inhibition de la synthèse ou la libération des prostaglandines. L'absence de différence significative dans les premières heures pourrait être due au manque d'influence de SAPE sur les médiateurs précoces, à savoir l'histamine, la sérotonine ou la bradykinine. Initialement au cours de la première heure après l'injection de carraghénine, ces médiateurs précoces sont libérés, suivis de la libération de prostaglandines vers la 3ème heure. Les résultats indiquent donc que la SAPE pourrait agir comme inhibiteur des enzymes cyclooxygénases impliquées dans la synthèse des prostaglandines33.

Les poids initiaux des rats sont présentés dans le tableau ST3. Une perte de poids chez les animaux peut survenir après un traitement avec des anti-inflammatoires non stéroïdiens. Cette perte de poids peut résulter principalement de la cachexie, dont la cause principale peut être due à un excès de cytokines34. Cependant, comme le montre la figure SF12, une augmentation constante du pourcentage de poids corporel avec le temps a été observée dans les trois groupes. L'augmentation était cependant plus élevée dans le groupe témoin par rapport aux groupes traités par SAPE et traités par l'indométhacine. Les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI) comme la maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (CU) sont marquées à l'aide de l'indice d'activité de la maladie (DAI) qui permet d'évaluer l'activité de la maladie à un moment donné35. Les critères de notation DAI et les scores DAI des différents groupes de traitement de rats sont présentés dans les tableaux ST4 et ST5, respectivement. Il a été constaté que le groupe induit par la colite sans aucun traitement (RG-CI) marquait le score le plus élevé pour le DAI avec 2,42, alors que dans le groupe témoin, il était de 0. Les groupes traités à la SAPE (1,04 DAI) et à l'indométhacine (0,92 DAI) ont enregistré scores inférieurs à ceux du groupe RG-CI. Par conséquent, il y avait une différence marquée dans le degré de maladie induite après que les modèles de rats aient subi un prétraitement avec SAPE.

Les intestins excisés des différents groupes de rats après traitement et euthanasie, et leurs images SEM sont présentés à la Fig. 8. Un certain degré de lésion tissulaire et de rupture a été observé dans les groupes induits par la colite (RG-CI, RG-SP et RG-IM ), ce qui n'a pas été observé dans le groupe témoin. Par rapport au groupe induit par la colite sans aucun traitement, les images SEM pour les groupes traités par SAPE et indométhacine ont montré une réduction distinctive du niveau de lésion tissulaire. Cela indique clairement une réduction marquée de l'étendue de la colite après traitement avec SAPE.

Intestins excisés et images SEM de la section intestinale de rats (A) RG-CF (groupe témoin sans colite sans aucun traitement), (B) rats RG-CI (groupe induit par colite sans aucun traitement), (C) RG-SP ( rats RG-IM (groupe induit par colite traité avec SAPE), rats RG-IM (groupe induit par colite traité avec indométhacine).

Les dommages oxydatifs induits par l'inflammation sont aggravés par la diminution des activités des enzymes antioxydantes telles que la catalase (CAT), la glutathion S-transférase (GST) et la gamma-glutamyltransférase (GGT) qui agissent comme des piégeurs de radicaux libres dans des conditions associées au stress oxydatif36. Les acides gras polyinsaturés, les glycolipides, les phospholipides et le cholestérol sont des cibles bien connues de la modification peroxydative37 et les cibles les plus courantes sont les composants des membranes biologiques38. La peroxydation lipidique produit une grande variété de produits d'oxydation secondaires, comme les aldéhydes, parmi lesquels le malondialdéhyde (MDA) est le plus mutagène37. Le MDA est un aldéhyde de faible poids moléculaire qui est généré en tant que produit final par décomposition de l'acide arachidonique et d'AGPI plus gros, par des processus enzymatiques ou non enzymatiques. Une production excessive de MDA a été associée à différents états pathologiques et les sujets touchés par plusieurs maladies ont des niveaux accrus de MDA. Par conséquent, il est utilisé comme biomarqueur pratique pour la peroxydation des lipides grâce à sa réaction facile avec l'acide thiobarbiturique (TBA)37,38. Les résultats du dosage de la teneur en MDA dans l'extrait de tissu intestinal pour différents groupes de traitement de rats sont illustrés sur la figure 9a. On a vu qu'il y avait une différence significative (P ≤ 0,05) dans le contenu de MDA parmi tous les groupes. Le groupe induit par la colite sans aucun traitement présentait la teneur la plus élevée (0,26 pg/µl), tandis que la teneur était inférieure dans le groupe traité par SAPE (0,10 pg/µl) par rapport au groupe traité par l'indométhacine (0,16 pg/µl). Par conséquent, la SAPE pourrait être considérée comme un puissant inhibiteur de la peroxydation lipidique dans les tissus enflammés. CAT est considéré comme un biomarqueur sensible du stress oxydatif dans les cellules car il s'agit d'un composant de défense antioxydant principal pour protéger les cellules contre le stress oxydatif en éliminant le peroxyde d'hydrogène toxique de l'environnement intracellulaire et extracellulaire. Les résultats du dosage de la concentration de catalase (CAT) dans l'extrait de tissu intestinal pour différents groupes de traitement de rats sont présentés sur la figure 9b. On a vu qu'il y avait une différence significative (P ≤ 0,05) dans le contenu de CAT entre tous les groupes. Le groupe induit par la colite sans aucun traitement présentait la teneur la plus faible (35,25 mU/mL), tandis que le groupe témoin enregistrait la teneur la plus élevée (201,25 mU/mL). La teneur était à nouveau plus élevée dans le groupe traité par SAPE (168,75 mU/mL) par rapport au groupe traité par l'indométhacine (152,00 mU/mL), indiquant ainsi un rôle positif de SAPE dans la synthèse et l'activité de l'enzyme antioxydante CAT.

(a) Teneur en malondialdéhyde (MDA); (b) teneur en catalase (CAT); (c) activité γ-glutamyl transférase (GGT); (d) activité glutathion S-transférase (GST); (e) teneur en facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et (f) teneur en interleukine 6 (IL-6) dans l'extrait de tissu intestinal pour différents groupes de traitement de rats (RG-CI : groupe induit par la colite sans aucun traitement ; RG- CF : groupe contrôle sans colite sans aucun traitement ; RG-SP : groupe colite induite traité par SAPE ; Groupe RG-IM : groupe colite induite traité par indométhacine).

La GGT contribue au catabolisme extracellulaire du glutathion (GSH), car elle catalyse le transfert de la fraction gamma-glutamyle du GSH conjugué vers des accepteurs tels que les acides aminés et les dipeptides. Il décompose également le GSH en ses acides aminés constitutifs et fournit ainsi la synthèse de novo d'acides aminés cystéine limitant le taux de GSH40. Les niveaux de GGT dans le sérum sont déterminés par plusieurs facteurs tels que l'inflammation, les maladies alcooliques du foie, les maladies de la vésicule biliaire et des voies biliaires, la teneur plasmatique en lipides/lipoprotéines, l'hypertension, l'hyperuricémie, le diabète et divers médicaments40,41. Les résultats du dosage de l'activité GGT dans l'extrait de tissu intestinal pour différents groupes de traitement de rats sont présentés sur la figure 9c. On a vu qu'il y avait une différence significative (P ≤ 0,05) dans le contenu de GGT parmi tous les groupes. Le groupe induit par la colite sans aucun traitement a enregistré la teneur la plus élevée (13,32 nmole/unité/mL). Le contenu à la fois dans le groupe traité par SAPE (5,21 nmole/unité/mL) et dans le groupe traité par l'indométhacine (6,39 nmole/unité/mL) était supérieur à celui du groupe témoin (2,16 nmole/unité/mL). Alternativement, les GST sont des enzymes majeures de détoxification de phase II qui catalysent la conjugaison des substrats électrophiles au GSH, et ont également d'autres fonctions comme les activités peroxydase et isomérase, protégeant les cellules contre la mort cellulaire induite par H2O2 et la liaison non catalytique des ligands endogènes et exogènes. . Ils entraînent la formation de conjugués GSH, qui sont finalement éliminés par plusieurs mécanismes de transport tels que la pompe GS-X dépendante de l'ATP, entre autres42,43. Les résultats de l'analyse de l'activité GST dans l'extrait de tissu intestinal pour différents groupes de traitement de rats sont présentés sur la figure 9d. Une différence significative (P ≤ 0,05) dans l'activité GST a été observée parmi tous les groupes. Le groupe témoin a enregistré l'activité la plus faible (0,17 µmole/mL/min), tandis que le groupe induit par la colite sans aucun traitement a présenté l'activité la plus élevée (0,29 µmole/mL/min). L'activité était cependant plus élevée dans le groupe traité par SAPE (0,26 µmole/mL/min) que dans le groupe traité par l'indométhacine (0,24 µmole/mL/min). L'induction de GGT et de GST dans les cellules se produit comme une adaptation protectrice contre les oxydants qui sont produits au cours du métabolisme normal ou si le stress oxydatif augmente en raison de tout facteur comme la présence de ROS44, et les résultats obtenus suggèrent une réduction du niveau de stress oxydatif avec le application de SAPE en cas de maladie.

Les cytokines sont des stimulateurs de la production de protéines de phase aiguë qui sont produites au cours des processus inflammatoires. Ces cytokines associées à l'inflammation comprennent l'interleukine-6 ​​(IL-6), l'IL-1β, le facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α), l'interféron-γ, le facteur de croissance transformant-β, l'IL-8, les facteurs de stimulation des colonies et les facteurs de croissance. . La pléiotropie fonctionnelle et la redondance sont des caractéristiques caractéristiques de ces cytokines45,46. Le TNF-α est une cytokine pro-inflammatoire impliquée dans la réponse immunitaire innée47. Les macrophages sont les principaux producteurs de TNFα et au niveau cellulaire, ils régulent un certain nombre de fonctions cellulaires critiques, notamment la survie cellulaire, la prolifération cellulaire, la différenciation et l'apoptose, qui sont médiées par les deux récepteurs transmembranaires, TNF-R1 et TNF-R2. En général, le TNFα ne provoque généralement pas la mort cellulaire, mais favorise la transcription génique et l'activation cellulaire9,48. Dans un état pathologique, la production de TNFα et la signalisation des récepteurs du TNF régulent de nombreuses facettes de la fonction des macrophages. Il joue un rôle central dans l'orchestration de la production d'une cascade de cytokines pro-inflammatoires dans de nombreuses maladies inflammatoires telles que la maladie de Crohn, la polyarthrite rhumatoïde, l'athérosclérose, la septicémie, le psoriasis, le diabète et l'obésité. C'est l'un des médiateurs précoces les plus abondants dans les tissus enflammés car il est rapidement libéré après un traumatisme, une infection ou une exposition au LPS48 d'origine bactérienne. Les résultats de l'analyse de la teneur en TNF-α dans l'extrait de tissu intestinal pour différents groupes de traitement de rats sont présentés sur la figure 9e. La teneur en TNF-α était la plus faible dans le groupe témoin (7,65 pg/mL). La teneur en TNF-α dans les groupes traités à la SAPE (14,66 pg/mL) et à l'indométhacine (13,75 pg/mL) était inférieure à celle du groupe induit par la colite sans aucun traitement (22,28 pg/mL).

L'IL-6 est une cytokine pléiotrope produite au site de l'inflammation et joue un rôle clé dans la réponse de phase aiguë, la régulation des réponses immunitaires et l'hématopoïèse49. Il est également impliqué dans la régulation des processus métaboliques, régénératifs et neuronaux. Les changements de phase aigus reflètent la présence et l'intensité de l'inflammation et l'IL-6 est le principal stimulateur de la production de la plupart des protéines de phase aiguë45. L'IL-6 peut être produite par une variété de cellules suite à une stimulation telle qu'une infection, un traumatisme ou une provocation immunologique. Il a également été découvert qu'il avait un rôle protecteur dans le modèle de choc septique LPS-galactosamine chez la souris49. Les résultats du dosage de la teneur en IL-6 dans l'extrait de tissu intestinal pour différents groupes de traitement de rats sont présentés sur la figure 9f. Sa teneur était la plus faible dans le groupe témoin (26,91 pg/mL). Il n'y avait pas de différence significative de contenu entre les groupes traités par SAPE (90,76 pg/mL) et indométhacine (82,83 pg/mL), et les deux ont révélé un contenu beaucoup plus faible que le groupe induit par la colite sans aucun traitement (109,56 pg/mL). Les résultats des tests IL6 et TNF-α ont clairement indiqué une diminution du niveau d'inflammation après traitement avec SAPE.

L'estérification sélective catalysée par Zn(OTf)2 a été utilisée avec succès pour la production d'ester phényléthylique d'acide salicylique (SAPE). Cet ester s'est avéré non cytotoxique, avec des effets anti-inflammatoires et antioxydants prometteurs, et les résultats étaient au même niveau que les agents AINS établis. L'ester a présenté une activité anticancéreuse contre les cellules cancéreuses du sein MCF7 via l'arrêt du cycle cellulaire sous-G1, la réduction des MMP, l'accumulation de ROS et l'induction de l'apoptose et de l'autophagie. Les résultats donnent pour la première fois un aperçu de l'utilisation de cet ester particulier en tant qu'agent thérapeutique anti-inflammatoire et anticancéreux potentiel. Des recherches supplémentaires élucidant l'absorption cellulaire et le métabolisme de la SAPE aideraient à corroborer cet ester en tant qu'AINS.

Un échantillon de sang humain pour l'obtention de cellules mononucléaires primaires du sang périphérique (PBMC) a été prélevé volontairement au Centre de santé de l'Université de Tezpur, Assam, Inde. La lignée cellulaire de cancer du foie humain embryonnaire (HepG2), la lignée cellulaire d'adénocarcinome colorectal épithélial (CaCo-2) et la lignée cellulaire de cancer épithélial du sein (MCF-7) ont été obtenues auprès du National Center for Cell Science (NCCS), Pune, Inde. Les milieux pour la culture de cellules animales ont été achetés auprès de HiMedia, Inde et les produits chimiques et solvants ont été obtenus auprès de Sigma Aldrich, États-Unis et Merck, Allemagne.

De l'acide salicylique (1,0 équiv) sous atmosphère de N2 a été ajouté à une solution agitée d'I2 (2,0 équiv) et de triphénylphosphine (2,0 équiv) dans de l'acétonitrile sec (10 ml) et le mélange réactionnel a été vortexé pendant 10 min, puis Zn(OTf) 2 (5 % en moles) a été ajouté. L'agitation a été poursuivie pendant 30 min à 60 ° C, puis de l'alcool phényléthylique (1,1 équiv.) a été ajouté dans de l'acétonitrile sec. Une fois la réaction terminée (contrôlée par CCM), le mélange a été refroidi à 30°C et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans de l'acétate d'éthyle et lavé avec du NaHC03 saturé suivi d'une solution de saumure. La couche organique a été séchée sur du Na2S04 anhydre et concentrée sous vide. La chromatographie sur colonne avec du gel de silice et un système de solvant à gradient d'acétate d'éthyle à l'hexane a donné le composé cible50 et validé comme mentionné dans la section "Étude RMN et FTIR pour la validation structurelle de SAPE".

Les études RMN 13C et 1H ont été menées dans un spectrophotomètre RMN (ECS-400, JEOL, Japon) et le logiciel utilisé pour l'acquisition des données était Delta, Ver. 4.3.6. Les composés d'essai ont été dissous dans du chloroforme de qualité RMN et l'intensité du champ a été fixée à 9,389766 [T] (400 MHz). Les lectures FTIR ont été prises dans un spectrophotomètre FTIR (Spectrum 100, Perkin Elmer, USA). Les données ont été recueillies en mode absorbance (A) et la gamme de longueurs d'onde choisie était de 4000 à 400 cm-1. La résolution et le nombre de scans par échantillon étaient respectivement de 4 cm-1 et 4.

Pour la simulation d'amarrage moléculaire, la structure de SAPE, d'indométhacine et d'ibrupofène a été générée à l'aide de ChemOffice 2010 (Cambridge Soft, Massachusetts, États-Unis). Les composés ont ensuite été convertis au format 3D pour les simulations d'amarrage et leurs géométries ont été optimisées à l'aide des méthodes de champ de force MM251 et enregistrées sous le nom de sybyl mol2. Les tests ADME-Tox in silico liés à la SAPE ont été réalisés à l'aide du logiciel ACD/Labs I-Lab 2.0 (Advanced Chemistry Development Inc, Toronto, Canada).

L'amarrage moléculaire de SAPE et de deux autres agents anti-inflammatoires établis, à savoir l'indométhacine et l'ibrupofène, a été effectué contre COX-2 (PDB ID : 4PH9) à l'aide de Molegro Virtual Docker (MVD) 6.01 (CLC bio, Aarhus, Danemark). Un algorithme de prédiction de cavité basé sur une grille a été utilisé en employant une grille discrète de résolution de 0, 8 Å pour couvrir la protéine, puis en plaçant une sphère de rayon de 1, 4 Å. La sphère a été vérifiée pour les chevauchements avec d'autres sphères et les cavités trouvées ont été classées en fonction de leur volume21. Pour les simulations d'amarrage, la liaison et la chaîne latérale ont été définies avec une tolérance de 1,7 et une force de 0,7 et le seuil de déviation quadratique moyenne (RMSD) pour les poses de cluster multiples a été fixé à 2,00 Å. L'algorithme d'amarrage a été fixé à 1 500 itérations maximales, 50 tailles d'évolution simplex et 100 exécutions minimales pour chaque composé. Les poses moléculaires ont été classées sur la base du score MolDock et Rerank, visualisées et les meilleurs résultats d'amarrage ont été sélectionnés pour l'analyse de l'interaction ligand-protéine.

Des études de simulation MD ont été menées pour les meilleurs coups d'amarrage contre le complexe ancré protéine-ligand. La topologie du ligand et les charges atomiques ont été générées à l'aide du serveur PRODRG52, la valeur de charge étant définie sur complète tandis que la chiralité était définie sur la valeur par défaut sans autre minimisation d'énergie. Les systèmes ont été traités à l'aide du champ de force Gromos 43a1 dans lequel le système protéine-ligand était immergé dans l'eau et les énergies étaient minimisées, suivies d'équilibrages NVT (canonique) et NPT (isotherme-isobare). Les structures équilibrées ont été soumises à une simulation MD de 20 ns, et la trajectoire a été analysée et tracée pour le squelette RMSD.

La conformation de la meilleure pose d'amarrage SAPE a été exportée et les calculs DFT ont été effectués à l'aide de Gaussian 09. Les calculs théoriques ont été effectués à l'état fondamental à l'aide de l'ensemble de base DFT/B3LYP/6–31. La méthode de conjecture a été définie comme Huckel étendu avec un mélange d'orbitales HOMO et LUMO. Les énergies orbitales moléculaires ont été prises en compte pour le calcul de la bande interdite ΔELUMO-HOMO.

L'autorisation nécessaire du comité d'éthique pour l'utilisation de sang humain a été obtenue auprès du Comité d'éthique de l'Université de Tezpur (TUEC), Université de Tezpur, Tezpur (Protocole n° DoRD/TUEC/10-14/4361 du 28.03.2014). Le consentement préalable a été obtenu de tous les volontaires pour donner du sang afin d'obtenir les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) et les globules rouges (RBC) nécessaires à cette expérience. Toutes les cellules ont été cultivées dans un environnement stable avec 5 % de CO2 à 37 °C. Les PBMC ont été isolés par centrifugation en gradient de densité et ensemencés dans du milieu RPMI-1640 (3 × 103/200 µL) additionné de 10 % de FBS dans des plaques à 96 puits. Les cellules CaCo-2 ont été cultivées dans un milieu MEM contenant 20 % de sérum bovin fœtal, les cellules HepG-2 ont été cultivées dans un milieu DMEM et les cellules MCF-7 ont été cultivées dans un milieu MEM contenant 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 mg/ L streptomycine.

Les globules rouges ont été isolés du sang, lavés avec du PBS (pH 7,4), centrifugés à 2000 tr/min pendant 10 min puis 2 % de la suspension d'érythrocytes (ES) ont été remis en suspension dans une solution saline. Le mélange réactionnel contenait 100 μL d'ES, 0,1% de Triton X-100 et 25, 50 ou 100 μg/mL de SAPE dans des microplaques à 96 puits et incubé pendant 60 min à 37 °C sous agitation constante puis centrifugé à 2000 tr/min pendant 10 minutes. La libération d'hémoglobine a été déterminée par analyse photométrique du surnageant à 576 nm. Utilisation de 0,1 % de Triton X-100 (comme contrôle positif) et de PBS (comme contrôle négatif) pour obtenir respectivement 100 % et 0 % d'hémolyse53.

Les cellules PBMC, HepG-2, CaCo-2 et MCF-7 (2 × 103) ont été ensemencées dans des plaques 96 puits et traitées avec des concentrations croissantes (25, 50, 100 et 200 µg/mL) de SAPE pendant 48 h à 37 °C, 5 % CO2. Ensuite, 20 µL (5 mg/mL dans du PBS) de solution MTT ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant 4 h à 37 °C. Après avoir retiré le milieu, les formazons ont été dissous dans du DMSO et la densité optique a été mesurée à 570 nm. Le rapport inhibiteur de la viabilité cellulaire a été calculé par rapport aux cellules témoins cultivées dans des milieux sans médicament54.

L'effet de SAPE sur la viabilité des cellules MCF-7 a également été évalué par le test d'exclusion du colorant bleu trypan. Les cellules (2 × 103) ont été cultivées avec différentes concentrations (25, 50 et 100 µg/mL) de SAPE dans du DMSO à 0,1 % et incubées pendant 48 h. Un total de 0,2 ml de solution de cellules trypsinisées a ensuite été mélangé avec 0,5 ml de bleu trypan à 0,4% dans du PBS, et après 5 min, les cellules colorées (mortes) et non colorées (viables) ont été comptées à l'aide d'un hémocytomètre31.

Les composés à savoir. La SAPE, l'acide salicylique et l'alcool phényléthylique (25, 50 et 100 µg/mL) ont été testés pour leur efficacité à inhiber la production de COX-2 et comparés à l'indométhacine. Dans le test cellulaire stimulé, les cellules CaCo-2 ont été pré-incubées dans des milieux MEM comme mentionné précédemment (section "Culture de PBMC, HepG-2, CaCo-2 et MCF-7cells") en présence et en l'absence des composés à tester pendant 1h. Lipopolysaccharides (LPS) d'Escherichia coli 0111 : B4 (10 µg/mL) a ensuite été ajouté à la suspension cellulaire et incubé pendant 48 h à 37 °C et 5 % de CO2. Après avoir retiré le milieu, les cellules ont été lavées avec du PBS, ajoutées dans un tampon d'extraction cellulaire glacé (0, 1 g / ml) et lysées à l'aide d'un batteur à billes (607EUR, BioSpec Products, USA). Le surnageant du lysat tissulaire a été recueilli par centrifugation (12 000 × g pendant 10 min à 4 °C) et la libération de Cox-2 a été mesurée à l'aide d'un kit ELISA COX-2 humain (RAB1034, Sigma-Aldrich, USA) en suivant les instructions du fabricant et les lectures ont été prises dans un lecteur de microplaques (GloMax Explorer, Promega, USA).

Pour le test de séquestration directe de la COX-2, un kit de dépistage fluorimétrique des inhibiteurs de la COX-2 (MAK399, Sigma Aldrich, USA) a été utilisé. Le dosage était basé sur la détection fluorométrique de la prostaglandine G2, le produit intermédiaire généré par l'enzyme COX. Tous les paramètres du dosage ont été effectués selon les instructions du fabricant et la fluorescence a été mesurée immédiatement en mode cinétique à l'aide d'un lecteur de microplaques à λEx = 535 nm/λEm = 587 nm à 25 °C pendant 5 à 10 min. Les valeurs IC50 pour chacun des composés ont été calculées en utilisant le logiciel CompuSyn (ComboSyn, Inc.).

Les cellules MCF-7 à 1 × 105 cellules/puits ont été traitées avec différentes concentrations (25, 50 et 100 μg/mL) de SAPE. Après 48 h d'incubation, les cellules adhérentes et flottantes ont été collectées par trypsinisation, lavées deux fois avec du PBS glacé, fixées dans du méthanol à 70 % glacé pendant une nuit à -20 °C, puis incubées avec de l'iodure de propidium (20 µg/mL) et RNase A (200 µg/mL) pendant encore 30 min à 37 °C. La distribution du cycle cellulaire a ensuite été analysée par cytomètre en flux (BD FACS LSR III, BD Biosciences, USA). Enfin, le pourcentage de cellules dans différentes phases du cycle cellulaire a été déterminé par le logiciel BD Diva.

Pour la détection quantitative de la génération de ROS intercellulaires, des cellules MCF-7 ont été ensemencées à une densité de 1 × 105 dans des plaques de culture à 6 puits pendant 24 h, suivies d'un traitement avec diverses concentrations (25, 50 et 100 μg/mL) de SAPE pendant 48h. Par la suite, les cellules ont été trypsinisées et lavées avec du PBS et colorées avec du diacétate de dichloroflourecien 25 mM pendant 30 min à 37 ° C dans l'obscurité et les niveaux relatifs de ROS des cellules ont été quantifiés par FCA 30.

Le traitement des cellules MCF-7, comme mentionné dans la section précédente "Analyse du cycle cellulaire", a été suivi d'une incubation avec 400 μl de 50 μM Rhodamine 123® à 37 ° C pendant 30 min avec agitation verticale à des intervalles de 5 min. Les cellules ont ensuite été lavées trois fois avec du PBS et l'intensité de fluorescence de la Rhodamine 123® a été mesurée par FCA avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission fixées respectivement à 488 nm et 525–530 nm. L'intensité de fluorescence moyenne (MFI) représente donc les niveaux cellulaires de potentiel de membrane mitochondriale intracellulaire (MMP) 30.

Comme mentionné dans 2.5.1, les cellules MCF-7 (1 × 105 cellules/mL) ont été traitées avec différentes concentrations (0, 50 et 100 μg/mL) de SAPE. Ensuite, les cellules ont été centrifugées à 3000 rpm pendant 5 min à 15°C et le culot a été lavé deux fois avec du PBS. Le culot a été remis en suspension dans 50 µL de PBS et hors de la suspension, 25 µL ont été mélangés avec 2 µL de mélange d'acridine orange (AO) et de bromure d'éthidium (EB) (100 µg/mL-1:1) pendant 10 min et conservés dans un incubateur à 37°C. Les cellules ont ensuite été montées sur une lame de verre avec lamelle et visualisées au microscope à fluorescence (Leica DM300, Allemagne)30.

Pour l'analyse qualitative de l'autophagie intracellulaire par microscopie à fluorescence29, l'imagerie a été réalisée en ensemençant les cellules sur une plaque à 6 puits chargée par lamelle à 1 × 105 cellules/puits. Par la suite, les cellules ont été traitées avec SAPE et traitées comme indiqué en 4.6.1. Enfin, après lavage avec du PBS, les cellules ont été colorées avec de l'AO et montées sur un microscope et les images ont été capturées en utilisant les paramètres de filtre appropriés dans un microscope composé (Leica DM3000, USA).

Par la suite, comme dans 2.5.1, les cellules MCF-7 (1 × 105 cellules/mL) ont été traitées avec différentes concentrations (0, 50 et 100 μg/mL) de SAPE. Ici, le milieu a été retiré et les cellules ont été colorées avec 1 μg/mL d'AO à 37 °C pendant 15 min, puis lavées avec du PBS et immédiatement analysées par FCA.

Cela a été fait selon Olive et Banáth32. En bref, 0,4 mL de cellules MCF-7 (2 × 104 cellules/mL) ont été mélangés avec 1,2 mL d'agarose à 1 % à 40 °C, et 1,2 mL de cette suspension cellulaire ont été déposés sur la surface recouverte d'agarose d'un pré- lame revêtue (agarose 1%). Les lames ont ensuite été doucement immergées dans une solution de lyse (2 % de sarkosyl, 0,5 M de Na2EDTA et 0,5 mg/ml de protéinase K, pH 8,0) à 4 °C et incubées à 37 °C pendant 20 h dans l'obscurité. Il a ensuite été immergé dans une solution tampon d'électrophorèse (pH 8,5) pendant 30 min et soumis à une électrophorèse dans le même tampon pendant 25 min. La coloration a été effectuée avec 2,5 µ/mL d'iodure de propidium dans de l'eau distillée et les cellules ont été analysées (50 images de comètes par diapositive) à l'aide du logiciel Open Comet en examinant des images de comètes individuelles pour la zone de la comète et la longueur de la queue de la comète.

Les études animales ont été menées avec des rats albinos (Rattus norvegicus de variété Wistar) au Defense Research Laboratory, Tezpur (numéro d'enregistrement CPCSEA : 1127/bc/07/CPCSEA), Assam. L'autorisation nécessaire du comité d'éthique pour mener les études sur les animaux a été obtenue auprès du Comité institutionnel d'éthique animale (IAEC), Laboratoire de recherche sur la défense, Tezpur (protocole n° 01/mai/2016 du 03/06/2016). Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives et réglementations en vigueur. De plus, la notification des études impliquant des rats a suivi les recommandations énoncées dans les directives ARRIVE.

Les rats (âgés de 2 mois) ont été hébergés à (20 ± 1) °C, (60 ± 5) % d'humidité relative et cycle lumière/obscurité (12 h : 12 h) dans des conditions spécifiques de barrière exempte d'agents pathogènes. L'alimentation et l'eau des rongeurs ont été données ad libitum. Un modèle d'administration de médicaments avant le traitement a été utilisé et ils ont été divisés en cinq groupes de manière aléatoire avec un nombre égal d'hommes et de femmes. Groupe RG-CI : groupe colite induite sans aucun traitement (n = 8) ; Groupe RG-CF : groupe contrôle sans colite sans aucun traitement (n = 8) ; Groupe RG-SP : groupe colite induite traité par SAPE (n = 8) ; Groupe RG-IM : groupe induit par la colite traité par l'indométhacine (n = 8) et RG-PO : groupe modèle induit par l'œdème de la patte (n = 8).

Un œdème de la patte a été induit dans un groupe différent de rats (n = 8) en injectant 0,15 mL de carraghénane à 0,1 % dans la région sous-plantaire juste en dessous de la malléole latérale des deux pattes gauches. La SAPE et l'indométhacine (10 mg/kg de poids corporel) ont ensuite été administrées par voie transdermique. Le volume de la patte a été mesuré à 0, 1, 3 et 5 h à l'aide d'un pléthysmomètre numérique (Orchid Scientific, Inde) et le % d'œdème a été exprimé selon Upadhyay et al.55.

Du jour 1 au jour 16, SAPE et indométhacine ont été administrés à tous les membres des groupes respectifs (groupe RG-SP et RG-IM) à des doses de 250 mg et 1,5 mg, respectivement par kg de poids corporel. Après 4 h de la dernière dose, les rats des groupes RG-CI, RG-SP et RG-IM ont été provoqués par une injection intrapéritonéale de LPS d'Escherichia coli 0111 : B4 à une dose de 5 mg/kg de poids corporel. Tous les rats ont été euthanasiés après 24 h de challenge LPS par asphyxie au CO2. Post mortem, le côlon et l'intestin grêle ont été disséqués et rincés avec du PBS 1 × froid contenant de la pénicilline/streptomycine (100 UI/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) avec un cocktail d'inhibiteurs de protéase, puis ouverts dans le sens de la longueur et lavés abondamment avec du PBS. Des segments intestinaux (0,5 à 1,0 cm), à 2 cm de l'anus, ont été prélevés et fixés dans du formol tamponné neutre à 10 %. Les tissus ont été stockés dans des tubes apyrogènes/endotoxines et conservés congelés à –80 °C avant l'analyse.

Les poids corporels de tous les rats ont été enregistrés chaque jour avant le traitement et le taux de gain de poids corporel a été calculé. Les scores DAI ont été calculés en additionnant les scores combinés pour la perte de poids, la consistance des selles et les saignements fécaux, et en divisant cette somme par 356.

Les tissus ont été fixés avec du glutaraldéhyde à 3 %, lavés avec du tampon cacodylate de sodium 0,1 M et de nouveau fixés avec du tétroxyde d'osmium à 0,1 % dans du tampon cacodylate de sodium 0,1 M. La déshydratation a été effectuée en série avec 30 à 100 % d'acétone, suivie d'un séchage dans du tétraméthylsilane à 4 °C. Les microstructures ont été étudiées à l'aide d'un microscope électronique à balayage (JEOL JSM-6390LV, SEM, Oxford) à des grossissements de 500 × et 1000 × et une tension d'accélération de 20 kV.

Le niveau de peroxydation lipidique a été exprimé en quantité de malondialdéhyde (MDA) formé, et cela a été analysé à l'aide d'un kit d'analyse de peroxydation lipidique (MAK085, Sigma-Aldrich, USA) qui utilise une courbe standard de MDA allant de 0 à 20 nmole . La teneur en catalase (CAT) a été déterminée à l'aide d'un kit de dosage de catalase (A22180, Invitrogen, USA), et la concentration en catalase a été calculée à partir d'une courbe standard de catalase (0 à 4,0 U/mL) dans laquelle 1 unité d'enzyme a été définie comme la quantité qui décomposera 1,0 μmole de H2O2 par minute à pH 7,0 et à une température de 25 °C. Le dosage de l'activité γ-glutamyltransférase (GGT) a été réalisé à l'aide d'un kit de dosage GGT (MAK089, Sigma-Aldrich, USA) et d'une courbe standard pNA (0 à 40 nmole/puits), où une unité de GGT a été définie comme la quantité d'enzyme qui générera 1,0 µmole de pNA par minute à 37 °C. Le dosage de l'activité de la glutathion S-transférase (GST) a été réalisé à l'aide du kit de dosage GST (CS0410, Sigma-Aldrich, USA), et l'activité spécifique de la GST a été calculée en utilisant un coefficient d'extinction molaire du 1-chloro-2,4-dinitrobenzène Conjugué (CDNB)-GST.

Les tissus ont été homogénéisés par sonication avec du tampon RIPA et du PMSF 1 mM. Le lysat a été centrifugé à 13 000 × g et le surnageant a été encore dilué 1:10 à 1:100 fois avec un tampon de diluant standard avant l'analyse. Le dosage de l'interleukine 6 (IL-6) a été réalisé à l'aide du kit ELISA IL-6 souris (KMC0061, Invitrogen, USA) et d'une courbe standard Ms IL-6 (0–250 pg/mL). Le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) a été dosé en utilisant le kit ELISA TNF-α de souris (KMC3011, Invitrogen, USA) et une courbe standard Ms TNF-α (7,8–250 pg/mL).

Tous les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± SEM. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide de l'ANOVA après le test U de Mann-Whitney. Une valeur de P < 0,001, P < 0,01 et P < 0,05 ont été considérées comme indiquant une différence significative entre les groupes.

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Les auteurs remercient dûment l'aide reçue du directeur du Laboratoire de recherche sur la défense, Assam, Inde, ainsi que du professeur Anand Ramteke, Département de biologie moléculaire et de biotechnologie, Université de Tezpur, Assam, Inde, pour avoir gentiment autorisé la réalisation des expériences sur les animaux et des études sur les lignées cellulaires, respectivement. .

Département d'ingénierie et de technologie alimentaires, Université de Tezpur, Tezpur, Assam, Inde

Arup Jyoti Das et Sankar Chandra Deka

Département de biologie moléculaire et de biotechnologie, Université de Tezpur, Tezpur, Assam, Inde

Argent Kumar Das & Salam Pradeep Singh

Département de chimie, NN Saikia College, Titabar, Assam, Inde

Partha Pratim Saïkia

École des sciences de l'environnement, Université Jawaharlal Nehru, New Delhi, Inde

Neelu Singh et Paulraj Rajamani

Division de la technologie pharmaceutique, Laboratoire de recherche sur la défense, Tezpur, Assam, Inde

Johirul Islam et Pronobesh Chattopadhyay

Département de physique, Université de Tezpur, Tezpur, Assam, Inde

Aftab Ansari

Département des matériaux et des sciences de la vie, Shizuoka Institute of Science and Technology, Fukuroi, Japon

Tatsuro Miyaji

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AJD et PPS ont fait la conceptualisation ; AJD, SPS, MKD et AA ont formulé la méthodologie et effectué l'analyse et l'enquête formelles ; PR et NS ont supervisé les études sur les lignées cellulaires à JNU, Delhi ; JI et PC ont supervisé les expériences liées aux animaux au DRL, T. ; SCD et TM ont mis à disposition des ressources et supervisé l'ensemble des travaux ; L'AJD et le SCD ont rédigé la rédaction, c'est-à-dire la préparation du projet original, et tous les auteurs ont révisé le manuscrit.

Correspondance à Sankar Chandra Deka.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Das, AJ, Das, MK, Singh, SP et al. Synthèse de l'ester phényléthylique de l'acide salicylique (SAPE) et son implication dans les rôles immunomodulateurs et anticancéreux. Sci Rep 12, 8735 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-12524-7

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Reçu : 26 août 2021

Accepté : 18 avril 2022

Publié: 24 mai 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-12524-7

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