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Oct 26, 2023

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Rapports scientifiques volume 12,

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 19445 (2022) Citer cet article

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Trichoderma reesei est un hôte largement utilisé pour produire des cocktails de cellulase et d'hémicellulase pour la dégradation de la biomasse lignocellulosique. Nous rapportons ici une stratégie de modification génétique pour T. reesei industriel qui permet la production d'enzymes à l'aide de glucose simple sans inducteurs, tels que la cellulose, le lactose et le sophorose. Auparavant, le XYR1V821F ou XYR1A824V muté était connu pour induire la xylanase et la cellulase en utilisant uniquement le glucose comme source de carbone, mais sa composition enzymatique était biaisée vers les xylanases et ses performances étaient insuffisantes pour dégrader efficacement la lignocellulose. Par conséquent, nous avons examiné des combinaisons de XYR1V821F muté et de CRT1, BGLR, VIB1, ACE2 ou ACE3 exprimés de manière constitutive, connus sous le nom de régulateurs de cellulase et de facteurs essentiels pour l'expression de la cellulase dans la souche T. reesei E1AB1 qui a été fortement mutagénisée pour améliorer la productivité enzymatique et exprimer une ß-glucosidase pour des performances enzymatiques élevées. Les résultats ont montré que l'expression d'ACE3 sur la souche exprimant XYR1V821F mutée favorisait l'expression de la cellulase. De plus, la co-expression de ces deux facteurs de transcription a également entraîné une productivité accrue, avec une productivité enzymatique 1,5 fois plus élevée qu'avec l'expression unique conventionnelle de XYR1V821F muté. De plus, cette productivité était 5,5 fois plus élevée que la productivité avec une expression unique améliorée d'ACE3. De plus, bien que le domaine de liaison à l'ADN d'ACE3 ait été considéré comme essentiel pour la production de cellulase sans inducteur, nous avons constaté que l'ACE3 avec un domaine de liaison à l'ADN partiellement tronqué était plus efficace dans la production de cellulase lorsqu'il était co-exprimé avec un XYR1V821F muté. Cette étude démontre que la co-expression des deux facteurs de transcription, le XYR1V821F ou XYR1A824V et ACE3 mutés, a entraîné une composition enzymatique optimisée et une productivité accrue.

Remplacer les combustibles fossiles par des sources d'énergie écologiquement propres et renouvelables est essentiel pour bâtir une société durable. La biomasse lignocellulosique est la matière première durable la plus abondante pour la bioraffinerie et la production de biocarburants. Par conséquent, l'utilisation efficace de la biomasse lignocellulosique pourrait aider à résoudre le problème1,2.

Afin d'utiliser la biomasse lignocellulosique comme matière première, il est nécessaire d'hydrolyser la biomasse lignocellulosique en sucres simples à l'aide de cellulase et d'hémicellulase. Les cellulases et hémicellulases extracellulaires pour la dégradation de la biomasse lignocellulosique sont principalement produites par des champignons filamenteux3. En particulier, le champignon filamenteux Trichoderma reesei (téléomorphe Hypocrea jecorna) est un micro-organisme bien connu qui produit de grandes quantités d'enzymes mixtes cellulase et hémicellulase extracellulaires pour la dégradation de la biomasse lignocellulosique4,5. On s'attendait à ce qu'il soit le pilier de la production commerciale de cellulase, compte tenu des rapports selon lesquels des souches industrielles de T. reesei peuvent être utilisées pour obtenir jusqu'à plus de 80 g/L de protéine extracellulaire4,6,7,8. Néanmoins, l'hydrolyse enzymatique de la biomasse lignocellulosique nécessite de grandes quantités d'enzymes lignocellulolytiques, et le coût élevé des enzymes est reconnu comme un goulot d'étranglement majeur dans la production de biocarburants lignocellulosiques9,10,11,12.

L'une des meilleures solutions consiste à augmenter la capacité de production d'enzymes et à utiliser des sources de carbone peu coûteuses telles que le glucose. Par conséquent, les mécanismes de régulation de l'expression de la cellulase doivent être bien compris. Cependant, l'expression de la cellulase est régulée de manière complexe par plusieurs facteurs de transcription (TF), qui peuvent influencer directement ou indirectement l'expression du gène de la cellulase13. Par conséquent, les rôles spécifiques de divers facteurs et leur réseau réglementaire complet ne sont pas encore entièrement compris. Des études antérieures ont démontré le rôle de divers régulateurs de cellulase. Alors que XYR1, HAP2/3/5, ACE2, VEL1, ACE3, ARE1, CRZ1, STR1 et VIB1 sont des régulateurs positifs, CRE1, ACE1, RCE1, CTF1, LAE1 et PAC1 sont identifiés comme des régulateurs négatifs14,15. L'expression du gène de la cellulase nécessite la libération de la répression catabolique du carbone (CCR)16. Par conséquent, la modification des régulateurs de la cellulase par la technologie génétique est considérée comme efficace.

Le répresseur transcriptionnel CRE1 est un régulateur clé du CCR et est connu pour inhiber indirectement l'expression de la cellulase dans les champignons filamenteux en présence de glucose16. Dans Trichoderma, la troncature17, la délétion18 ou la mutagenèse dirigée multisite19 de cre1 atténue le CCR. Ainsi, il est possible d'améliorer considérablement l'expression du gène de la cellulase en présence de diverses sources de carbone telles que le glucose, le lactose, le sophorose et la cellulose20,21,22,23. En particulier, la suppression ou la troncature de cre1 conduit à une dérépression partielle de la cellulase et de l'hémicellulase lorsque des souches mutées par CRE1 sont cultivées dans un milieu contenant du glucose16,17,18,24. Cependant, dans un milieu ne contenant que du glucose sans sucres inducteurs, la souche mutée CRE1 ne peut libérer complètement le CCR. Ainsi, soit il réprime l'expression, soit il ne réprime ni n'active la cellulase ou l'hémicellulase, ce qui entraîne une faible production de cellulase. De plus, les répresseurs ace125 et rce126, ainsi que cre1, peuvent être supprimés pour améliorer les niveaux d'expression du gène de la cellulase, mais les inducteurs sont supposés être nécessaires à l'expression.

En revanche, XYR1, un régulateur positif nécessaire à l'expression de la plupart des gènes de cellulase et d'hémicellulase, a conduit à la possibilité d'exprimer ces gènes sans inducteurs par modification. XYR1 possède un domaine de liaison à l'ADN de type Zn(II)2Cys6, qui se lie directement aux régions en amont des gènes de la cellulase/hémicellulase27,28. La perturbation de xyr1 conduit à un phénotype cellulase négatif29, indiquant qu'il s'agit d'un facteur essentiel pour l'induction de la cellulase. XYR1 favorise l'augmentation de l'expression du gène de la cellulase dans des conditions de surexpression constitutive, alors qu'il n'augmente pas la production de cellulase dans les milieux avec du glucose comme seule source de carbone12. L'ingénierie des TF a également été mise en œuvre pour augmenter l'expression de la cellulase. Malgré les TF artificiels qui fusionnent XYR1 avec d'autres facteurs de transcription qui ont été développés et ont tenté de produire de la cellulase de manière constitutive en utilisant le glucose comme seule source de carbone, la productivité des protéines n'a pas conduit à une production induite. La souche mutée exprimant XYR1V821F ou XYR1A824V exprimait la xylanase et la cellulase même dans le glucose comme seule source de carbone et améliorait la productivité des protéines8,32,33. Néanmoins, les enzymes induites par le XYR1V821F ou XYR1A824V muté n'étaient pas suffisantes pour la dégradation efficace de la lignocellulose en raison de leur composition élevée en xylanase et faible en cellulase32,33. Par conséquent, pour produire des cellulase/hémicellulases à des niveaux similaires à l'état induit même dans des milieux avec du glucose comme seule source de carbone, nous avons supposé qu'il était nécessaire d'ajouter des facteurs qui activent l'expression de la cellulase travaillant en coopération avec XYR1, et nous avons recherché des facteurs coopératifs à exprimer avec XYR1V821F muté.

Les activateurs de transcription ACE234, ACE335 et VIB136 étaient des facteurs coopératifs putatifs. De plus, CRT137,38, un transporteur sensible à la cellulose impliqué dans la régulation de l'expression du gène xyr1, et BGLR39, un activateur de la β-glucosidase, ont été considérés comme tels.

ACE2 est un facteur de transcription qui améliore l'activation transcriptionnelle de cbh1, cbh2, egl1, egl2 et xyn2 chez T. reesei avec induction cellulosique34. Cependant, ACE2 n'est pas impliqué dans l'induction de sophorose. ACE2 se lie au même motif promoteur partagé avec XYR1, et la phosphorylation et la dimérisation sont des conditions préalables à la liaison d'ACE2 à son promoteur cible40.

Chez T. reesei, ACE3 est connu pour être impliqué dans la production de cellulase lors de l'induction avec du lactose35. ACE3 interagit avec XYR1 pour initier la production de cellulase41. L'introduction de plusieurs copies du gène ace3 améliore l'expression du gène de la cellulase et régule l'expression du gène de la xylanase35. De plus, l'ACE3 tronqué C-terminal peut induire des niveaux élevés d'expression de la cellulase et de l'hémicellulase dans des conditions non induites en utilisant du glucose et améliorer encore l'expression dans des conditions induites en utilisant du lactose ou un mélange glucose-sopholose42,43. Il montre une induction améliorée de la cellulase à la fois en présence et en l'absence d'un inducteur. De plus, la souche surexprimant XYR1 de type sauvage ou XYR1A824V muté et ACE3 tronqué C-terminal a amélioré la protéine sécrétée totale avec le lactose comme source de carbone. Cependant, lorsque le glucose était utilisé comme seule source de carbone, une surexpression supplémentaire de XYR1A824V muté en plus de l'ACE3 tronqué C-terminal n'a pas entraîné d'amélioration supplémentaire42.

Chez T. reesei, VIB1 est également essentiel pour la production de cellulase et agit comme un régulateur important de l'induction de cellulase36,44. Une comparaison des transcriptomes Δvib1 et Δxyr1 utilisant la cellulose comme source de carbone a montré une fréquence élevée de chevauchement entre les gènes induits par la cellulose régulés par les cibles VIB1 et XYR145. Cela suggère que VIB1 régule partiellement l'expression du gène de la cellulase via XYR145.

CRT1 a été considéré comme l'un des transporteurs les plus importants impliqués dans l'induction de la cellulase chez T. reesei37,38. Sa suppression s'est avérée abolir complètement l'expression du gène de la cellulase lors de l'induction avec de la cellulose et du lactose38. Récemment, CRT1 a été validé pour transporter le lactose, le cellobiose, le glucose et le soporose46. De plus, lorsque XYR1 est surexprimé dans des conditions contenant du glucose, la transcription de crt1 a été maintenue à un niveau relativement bas47.

Le BGLR, activateur de la β-glucosidase, est un facteur de transcription possédant un domaine de liaison à l'ADN de type Zn(II)2-Cys639. L'une des fonctions du BGLR est de réguler à la hausse certains gènes de la β-glucosidase39. Le mutant délété du gène bglr a montré une production accrue de cellulase pendant la croissance du cellobiose.

Nous avons examiné si le XYR1V821F muté et chacun des cinq facteurs qui lui seraient associés affectent la régulation de la production de cellulase et d'hémicellulase dans des conditions sans inducteur en utilisant le glucose comme source de carbone.

Nous avons utilisé une souche dérivée de PC-3-7, une souche productrice d'enzymes à haute performance de T. reesei qui est plus productive et a tendance à être atténuée par le CCR dans le glucose48,49,50. T. reesei est connu pour sécréter un ensemble complet de cellulases lorsqu'il est cultivé avec des inducteurs tels que la cellulose, le cellobiose et le sophorose5,51. En revanche, les activités CBH et EG de T. reesei sont connues pour être supérieures à celles des autres micro-organismes, mais son activité BGL est inférieure à celle des mélanges de cellulase provenant d'autres organismes52. Il en résulte une accumulation de cellobiose et une inhibition ultérieure du produit de CBH, réduisant l'efficacité de l'hydrolyse enzymatique. Pour résoudre ce problème, l'ajout de BGL est efficace pour améliorer les performances enzymatiques. Les coûts de production peuvent être réduits en surexprimant le BGL dans T. reesei. La souche E1AB1 possède un gène de β-glucosidase d'Aspergillus aculeatus (Aabgl) dans la souche PC-3-752,53,54.

Nous avons cherché à développer une souche qui ne nécessite pas d'inducteur pour la production de cellulase en utilisant E1AB1 comme souche productrice d'enzymes plus pratique. Nous avons tenté d'exprimer la cellulase par la co-expression des cinq facteurs candidats et du XYR1V821F muté, qui induit une production de xylanase de haut niveau dans des conditions non inductrices. Dans cette étude, le défaut d'induction insuffisante de la cellulase a été éliminé par l'expression constitutive de XYR1V821F et ACE3 mutés. Ainsi, nous rapportons que la production peu coûteuse d'enzymes de saccharification peut être réalisée sans inducteurs de cellulase.

Afin de combiner l'expression de XYR1V821F muté et de ses facteurs coopératifs candidats, deux sites d'insertion génomique étaient nécessaires pour exprimer XYR1V821F muté et chaque facteur. Par conséquent, nous avons utilisé les régions des gènes ace1 et rce1 codant pour les répresseurs transcriptionnels comme sites d'insertion.

Tout d'abord, une perturbation des gènes répresseurs ace1 et rce1 a été réalisée pour confirmer l'effet de la suppression. Les résultats ont montré que la productivité protéique des souches E1AB1, Δace1 et Δrce1 était réduite à moins de 10 % dans les conditions non inductrices avec le glucose comme source de carbone par rapport aux conditions inductrices avec la cellulose comme source de carbone dans la souche parentale E1AB1 (Fig. .1a). De plus, la perturbation d'ace1 ou de rce1 n'a pas modifié la composition des protéines sécrétoires, comme illustré à la figure 1b. Une bande de haute intensité indiquée par une flèche ouverte a été trouvée (Fig. 1b, pistes 2 à 4) et a été identifiée comme une protéine de la famille des glycosides hydrolases 55 (GH55) (Trire2_121746) par analyse nano LC – MS / MS. Cette protéine s'est avérée similaire à la β-1,3-glucanase Lam55A de Phanerochaete chrysosporium (fichier supplémentaire, tableau S1). Cela indique qu'une faible production de cellulase a été observée dans les trois souches avec le glucose comme seule source de carbone.

Effets de l'expression constitutive de XYR1 muté par V821F et perturbation des répresseurs sur la culture de glucose. ( a ) Protéine extracellulaire provenant de la culture d'échantillons après 72, 96 et 120 h. La souche E1AB1 de Trichoderma reesei a été cultivée dans des flacons agités sur un milieu inducteur contenant 3 % de cellulose, et les souches recombinantes E1AB1Δace1, E1AB1Δrce1, E1AB1-X (Δace1-Pact1-xyr1V821F) et E1AB1-XΔrce1 ont été cultivées sur un milieu non inducteur contenant 3 % de glycémie. (b) Analyse SDS-PAGE des protéines sécrétées après 72 h. T. reesei souche E1AB1 avec 3 % de cellulose (piste 1) et 3 % de cultures de glucose (piste 2) et souches recombinantes E1AB1Δace1 (piste 3), E1AB1Δrce1 (piste 4), E1AB1-X (piste 5) et E1AB1-XΔrce1 (piste 6) avec des cultures de glucose à 3 %. La pointe de flèche ouverte indique la confirmation dans la culture de glucose (pistes 2 à 4). Les pointes de flèches fermées indiquent des protéines clairement surexprimées, correspondant probablement à la xylanase principale (BXL1, XYN1, XYN2, pistes 5 et 6). Le gel a été recadré dans la plage de 15 à 250 kDa et le gel d'origine a été présenté dans le fichier supplémentaire Fig. S4. Les barres d'erreur indiquent les écarts types. La signification statistique a été déterminée par un test t de Student bilatéral non apparié. **p < 0,01.

Nous avons sélectionné le promoteur act1 comme promoteur constitutif non affecté par l'utilisation de la source de carbone, qui présentait des niveaux d'expression similaires à ceux de la pyruvate décarboxylase 1 (Trire2_121534) dans les résultats RNAseq obtenus dans des conditions de culture contenant de la cellulose et du glucose dans la souche E1AB154. Une cassette contenant XYR1V821F sous le promoteur act1 constitutivement actif a été introduite au locus ace1, et la souche a été nommée E1AB1-X. La souche E1AB1-X a produit 2,08 g/L de protéine extracellulaire dans des conditions non inductrices. Il s'agissait d'une multiplication par quatre de la production de protéines extracellulaires par rapport à la souche parentale (Fig. 1a). De plus, des différences dans les modèles de bandes ont été observées dans l'analyse SDS-PAGE (Fig. 1b, pointes de flèches fermées). Sur la base des poids moléculaires estimés et d'un rapport précédent53, les bandes protéiques correspondaient probablement aux principales xylanases (XYN1, XYN2) et à la β-xylosidase (BXL1 ; Fig. 1b, piste 5). Cependant, leur composition était différente de celle des protéines produites par la souche parentale E1AB1 dans une condition inductrice (Fig. 1b, pistes 1 et 5), et les intensités de bande correspondant aux cellulases (CBH1, CBH2, EG1) étaient également faibles.

Ainsi, les xylanases pourraient être produites par l'expression constitutive du XYR1V821F muté même dans des conditions sans inducteur ; cependant, les cellulases n'étaient pas entièrement produites. Une perturbation supplémentaire du gène rce1 dans la souche E1AB1-X a entraîné une augmentation de la productivité des protéines (Fig. 1a), mais aucun changement significatif dans la composition enzymatique (Fig. 1b, piste 6). Par conséquent, le locus rce1 a été utilisé pour tester l'amélioration de la productivité de la cellulase en co-exprimant les facteurs coopératifs candidats pour la production de cellulase.

La recombinaison homologue de crt1, bglr, vib1, ace2 et ace3, les activateurs de la cellulase et les facteurs essentiels à l'expression de la cellulase a été effectuée au locus rce1 du génome E1AB1-X, suivie d'une expression constitutive sous le promoteur act1. La co-expression constitutive de CRT1, BGLR, VIB1 ou ACE2 dans la souche E1AB1-X n'a ​​entraîné aucun changement significatif dans la concentration de protéines sécrétées (Fig. 2a) et les bandes avec des poids moléculaires correspondant à des cellulases telles que CBH1, CBH2 (Fig. .2b, voies 2 à 5). En revanche, la souche exprimant constitutivement ACE3, E1AB1-XA3, a montré une augmentation de 1,5 fois de la production de protéines par rapport à E1AB1-X (Fig. 2a). L'analyse de la composition enzymatique a révélé une bande diminuée correspondant aux xylanases (XYN1, XYN2 et BXL1) et quelques bandes d'intensité accrue, comme indiqué par les flèches fermées dans E1AB1-XA3 (Fig. 2b, piste 6). Ces bandes, identifiées par analyse nano LC-MS/MS, étaient principalement des cellulases (CBH1, CBH2 et EG1), des xylanases (BXL1 et XYN4) et de petites quantités de protéines impliquées dans la dégradation de la cellulose (SWO1, CIP2 et EG4) (Fichier supplémentaire Tableau S2).

Co-expression de facteurs impliqués dans la transcription de la cellulase dans la souche E1AB1-X. La souche E1AB1-X de Trichoderma reesei a été co-exprimée avec divers facteurs liés à l'expression de la cellulase et cultivée dans des flacons agités sur un milieu non inducteur contenant 3 % de glucose. ( a ) Protéine extracellulaire d'échantillons de culture après 96 h. (b) Analyse SDS-PAGE des protéines sécrétées après 72 h dans une culture de glucose de T. reesei E1AB1-X (piste 1, Δace1-Pact1-xyr1V821F, comme contrôle), E1AB1-XC (piste 2, Δace1-Pact1- xyr1v821f et ΔRCE1-PACT1-CRT1), E1AB1-XB (LANE 3, ΔACE1-PACT1-XYR1V821F et ΔRCE1-PACT1-BGLR), E1AB1-XV (LANE 4, ΔACE1-PACT1-XYR1V821F et ΔRCE1-PACT1-VIB1), E1AB1 -XA2 (piste 5, Δace1-Pact1-xyr1V821F et Δrce1-Pact1-ace2) et E1AB1-XA3 (piste 6, E1AB1-XA3, Δace1-Pact1-xyr1V821F et Δrce1-Pact1-ace3(PT)). Le gel a été recadré dans la plage de 15 à 250 kDa et le gel d'origine a été présenté dans le fichier supplémentaire Fig. S5. ( c ) Activité enzymatique volumétrique du surnageant de culture de 72 h. Une unité d'activité est définie comme la quantité d'enzyme qui a produit 1 μmol de p-nitrophénol par minute par mL de surnageant de culture à partir du substrat à 50 °C. Les graphiques à barres montrent l'activité relative à celle de E1AB1-X. Les barres d'erreur indiquent les écarts types. La signification statistique a été déterminée par le test t de Student bilatéral non apparié. **p < 0,01.

Pour mesurer l'activité enzymatique du surnageant de culture de la souche co-exprimant constitutivement ACE3, la pNPLase a été mesurée pour l'activité CBH1 et la pNPGase pour l'activité BGL. Les résultats ont montré que la souche E1AB1-XA3 était 4,9 fois plus élevée en pNPLase et 5,5 fois plus élevée en pNPGase par rapport à la souche E1AB1-X. Dans la souche E1AB1, la β-glucosidase d'A. aculeatus (Aabgl1) est exprimée à l'aide du promoteur egl1. L'augmentation de l'activité pNPGase suggère une meilleure transcription du promoteur egl1 dans la souche E1AB1-XA3. Ces valeurs d'activité pNPGase et pNPLase, qui indiquent l'activité cellulase, ont augmenté d'environ cinq fois. Alors que les valeurs d'activité pNPXase et pNPX2ase, qui indiquent l'activité xylanase, ont changé jusqu'à 1,8 et 0,8 fois. Le fait que l'activité de la xylanase ne se soit pas beaucoup améliorée, contrairement à la cellulase, suggère que l'ACE3 contribue à une amélioration spécifique de l'expression de la cellulase.

De plus, la bande de GH55 observée dans des conditions non inductibles (Fig. 1b, voies 2 à 4 avec pointe de flèche ouverte) a disparu dans le surnageant de la souche exprimant constitutivement ACE3. Lam55A, qui hydrolyse le β-1,3-glucane, pourrait réguler le métabolisme des sources externes de nutriments55. Ainsi, il a été déduit que les cellulases étaient induites dans la souche E1AB1-XA3 même en l'absence d'inducteurs, et la souche ressemblait à l'état activement induit pour la production de cellulase. Par conséquent, nous avons trouvé que la souche E1AB1-XA3, qui combine l'expression constitutive du XYR1V821F et de l'ACE3 mutés, permet de produire des xylanases et un rendement élevé de cellulases, même dans des conditions sans inducteur.

La souche E1AB1-XA3 avait une productivité de cellulase élevée même en l'absence d'inducteurs, indiquant qu'une combinaison d'ACE3 et de XYR1V821F muté est efficace pour une augmentation de l'activité de la cellulase (Fig. 2). En plus de la mutation V821F, la mutation A824V a été signalée précédemment comme étant l'une des mutations XYR1 qui permettent l'expression de la xylanase et de la cellulase sans inducteurs32. Par conséquent, pour confirmer les mutants XYR1 potentiellement utiles, les mutants V821F et A824V avec un phénotype aveugle au glucose ont été évalués avec le type sauvage (Fig. 3a). En revanche, des rapports ont suggéré qu'il existe une possibilité de plusieurs sites de début de transcription dans ace341,43. L'ace3 de E1AB1-XA3 utilisé dans la figure 2 est dérivé de la base de données du génome JGI (les séquences ORF (651 ou 629 acides aminés) présentées dans http://genome.jgi.doe.gov/Trire2/Trire2.home.html ) par référence. Cependant, des introns corrects et deux sites putatifs de début de transcription ont été proposés41,43. La séquence d'acides aminés complète estimée était de 734 acides aminés, et la séquence enregistrée dans JGI était un domaine de liaison à l'ADN N-terminal partiellement tronqué. Par conséquent, nous avons cloné les deux sites d'initiation de la traduction putatifs à partir de l'ADN génomique et examiné l'expression constitutive de l'ACE3 partiellement tronqué (PT-ACE3) et de l'ACE3 complet (FL-ACE3) (plus de détails sont fournis dans le fichier supplémentaire Fig. S1). De plus, nous avons effectué l'expression constitutive de XYR1 et ACE3 en utilisant une recombinaison non homologue pour déterminer si la perturbation des deux répresseurs (ace1 et rce1) était essentielle. Les souches, les sources de carbone et les génotypes utilisés dans cette étude ont été répertoriés dans le fichier supplémentaire, tableau S3.

Confirmation des combinaisons génétiques requises pour une production élevée de cellulase dans des conditions sans inducteur. ( a ) Domaine putatif de XYR1 et ACE3 utilisé dans l'étude, mutations d'acides aminés dans XYR1 et variante présumée d'ACE3. Des cultures en flacon agité ont été réalisées en utilisant 3 % de cellulose : Piste 1 et 3 % de glucose : Piste 2–9. Les souches utilisées dans cette figure étaient Pistes 1 et 2 : E1AB1, Piste 3 : E1AB1-X (Δace1-Pact1-xyr1V821F), Piste 4 : E1AB1-A3 (Δrce1-Pact1-ace3(PT)), Piste 5 : E1AB1- XA3 (Δace1-Pact1-xyr1V821F et Δrce1-Pact1-ace3(PT)), Piste 6 : E1AB1-XA3fl (Δace1-Pact1-xyr1V821F et Δrce1-Pact1-ace3(FL)), Piste 7 : E1AB1-XA3nhr (Pact1- xyr1V821F et Pact1-ace3(PT) par recombinaison non homologue), Piste 8 : E1AB1-X824A3nhr (Pact1-xyr1A824V et Pact1-ace3(PT) par recombinaison non homologue) et Piste 9 : E1AB1-XwtA3nhr (Pact1-xyr1WT et Pact1-ace3(PT) par recombinaison non homologue). Les sources de carbone, les souches et les génotypes utilisés dans cette figure ont été organisés dans un fichier supplémentaire, tableau S3. ( b ) SDS-PAGE des protéines sécrétées après 72 h de culture (2, 5 μg de protéine / piste). Le gel a été recadré dans la plage de 15 à 250 kDa et le gel d'origine a été présenté dans le fichier supplémentaire Fig. S6. ( c ) Concentration de protéines extracellulaires à 96 h. Niveaux de transcription relatifs de xyr1 (d) et ace3 (e). La PCR en temps réel a été réalisée sur les échantillons prélevés après 48 h. Les niveaux de transcription des souches pgk1 et E1AB1 sur culture de glucose ont été mesurés pour le calcul de référence et la normalisation des données, respectivement, et analysés à l'aide de la méthode ΔΔCt. Les barres d'erreur indiquent les écarts types. La signification statistique a été déterminée par un test t de Student bilatéral non apparié. **a indique p < 0,01 pour le test avec la voie 5 (E1AB1-XA3) et **b indique p < 0,01 pour le test avec la voie 7 (E1AB1-XA3nhr).

Dans toutes les souches exprimant constitutivement l'ACE3, la composition enzymatique des protéines sécrétées était principalement de la cellulase (Fig. 3b, voies 4, 5, 6, 7, 8 et 9). La production totale de protéines de la souche E1AB1-A3 exprimant PT-ACE3 (Fig. 3c, voie 4) et de la souche E1AB1-XwtA3 co-exprimant ACE3 avec XYR1 de type sauvage (Fig. 3c, voie 9) était de 0,57 g/L et 0,51 g/L, respectivement. Ces résultats ont indiqué que la co-expression d'ACE3 avec le XYR1V821F muté était efficace pour une productivité élevée. Pour qu'un XYR1 muté soit combiné, il n'est pas nécessaire qu'il soit spécifique de V821F, mais il doit au moins présenter un phénotype aveugle au glucose comme XYR1V821F ou XYR1A824V muté (Fig. 3b, c, pistes 7 et 8). De plus, la co-expression d'ACE3 était efficace avec des séquences partielles tronquées et pleine longueur, qui avaient toutes deux une composition dominée par la cellulase et montraient une productivité plus élevée qu'une seule expression de XYR1V821F (Fig. 3b, c, voie 6). Cependant, la productivité de la souche E1AB1-XA3fl avec FL-ACE3 était inférieure de 14 % à celle de la souche E1AB1-XA3 avec PT-ACE3 (Fig. 3c, piste 5). Ce résultat était surprenant car ACE3 avec un domaine de liaison à l'ADN partiellement tronqué avait une productivité supérieure. L'expression de XYR1V821F et ACE3 mutés par recombinaison non homologue (Fig. 3c, voie 7, souche E1AB1-XA3nhr) a montré le même effet de co-expression que ci-dessus. Cependant, la productivité des protéines était inférieure à celle de l'ace1 et rce1 a perturbé les souches E1AB1-XA3 (Fig. 3c, piste 5).

Les niveaux de transcription de xyr1 et ace3 ont été comparés dans les neuf souches répertoriées dans le tableau S3. Le transcrit xyr1 total a été mesuré avec une paire d'amorces dans les régions non mutées et a été mesuré pour WT, V821F et A824V spécifiquement en concevant une amorce inverse à la position mutée. Les amorces utilisées pour mesurer les transcrits ace3 ont été conçues par rapport à des séquences communes pour tous les ace3 et dans des séquences uniques à pleine longueur (exon 2) ou partielles tronquées (dans l'intron 2 à l'exon 3) (fichier supplémentaire, tableau S4). Par conséquent, les niveaux de transcription xyr1 ont augmenté de 11,5 fois dans la souche E1AB1-X, exprimant de manière constitutive le XYR1V821F muté par rapport à la souche parentale E1AB1 dans le milieu avec du glucose comme source de carbone. L'augmentation n'était pas seulement dans xyr1V821F mais aussi dans xyr1WT (xyr1 natif) de 4,2 fois (Fig. 3d, pistes 2 et 3). De plus, la transcription totale d'ace3 a été multipliée par 6, 2 dans la souche E1AB1-X, même si l'expression d'ace3 n'a pas été directement améliorée (Fig. 3e). Cela indique que l'expression de xyr1 et ace3 natifs est significativement améliorée directement/indirectement par XYR1V821F muté. De plus, dans la souche E1AB1-XA3 co-exprimant xyr1V821F et PT-ace3 mutés, les niveaux totaux de transcription xyr1 et ace3 ont augmenté jusqu'à 16, 8 et 8, 9 fois, respectivement, par rapport à la souche mère (Fig. 3d, e, voie 5 ). Dans le cas de la co-expression de xyr1WT et PT-ace3 sans utiliser xyr1 muté (souche E1AB1-XwtA3nhr), les niveaux totaux de transcription de xyr1 et ace3 ont augmenté de 6,7 fois (Fig. 3d, piste 9) et de 3,7 fois (Fig. 3e, piste 9), respectivement. Cependant, les niveaux de protéines sécrétées totales n'ont pas augmenté (Fig. 3c, piste 9). Ces résultats suggèrent qu'un certain niveau de XYR1 total ou de XYR1 muté, tel que XYR1V821F ou XYR1A824V muté, était nécessaire pour une production élevée de cellulase.

Ces résultats ont également indiqué que l'expression constitutive du XYR1 muté présentant un phénotype aveugle au glucose (comme V821F, A824V) et ACE3 (pleine longueur et partiellement tronqué) était nécessaire pour une production élevée de cellulase en l'absence d'inducteurs. De plus, la troncature partielle du domaine de liaison à l'ADN d'ACE3 et les perturbations d'ace1 et de rce1 ont contribué à une productivité élevée des protéines, et le génotype de la souche E1AB1-XA3 s'est avéré être la combinaison la plus efficace dans cette étude.

Nous avons analysé l'expression génique et l'activité de la cellulase et de la xylanase dans une seule expression de XYR1V821F (souche E1AB1-X), une seule expression de PT-ACE3 (souche E1AB1-A3) et la co-expression de XYR1V821F et PT-ACE3 (E1AB1 -souche XA3).

En raison de l'effet de la mutation XYR1V821F, la transcription des principales cellulases dans la souche E1AB1-X était supérieure d'environ quatre ordres de grandeur à celle de la souche parente E1AB1 (Fig. 4a). De plus, dans la souche E1AB1-XA3, l'expression constitutive de PT-ACE3 a entraîné une augmentation supplémentaire de 6, 4 fois des niveaux de transcrit de cellulase par rapport à la souche E1AB1-X (Fig. 4a). L'augmentation de l'expression des principales xylanases, xyn1 et xyn2, était au maximum de 1, 7 fois (Fig. 4a), ce qui était en accord avec leur activité enzymatique (Fig. 4b). Conformément à ces résultats, les enzymes produites par la souche E1AB1-XA3 présentaient une quantité similaire de xylanase et une augmentation spécifique des composants de la cellulase (CBH1, CBH2, EG1) par rapport à la souche E1AB1-X (Fig. 4c). La composition cellulase / xylanase de la souche E1AB1-XA3 dans la culture non induite utilisant du glucose était similaire à celle de la culture induite de la souche parentale E1AB1 utilisant de la cellulose (Fig. 4b, Fichier supplémentaire Fig. S2). Dans la souche E1AB1-A3, les activités dégradantes de pNPX2ase et pNPXase ont été peu détectées (Fig. 4b), et les bandes de BXL1, XYN1 et XYN2 ont pu être peu identifiées (Fig. 3b, Piste n°4). Par conséquent, l'expression unique constitutive d'ACE3 pourrait activer la production de cellulase mais ne pourrait pas activer complètement la production de xylanase (Fig. 3c). De plus, sur la base des concentrations de protéines et de la composition estimées à partir de SDS-PAGE, les quantités absolues de CBH1, CBH2 et EG1 étaient de 0,24, 0,34 et 1,25 g/L dans les souches E1AB1-X, -A3 et -XA3, respectivement. Cela confirme une régulation positive synergique de la cellulase lors de la co-expression de XYR1V821F et ACE3 mutés (Fig. 4c).

Analyse de l'expression des gènes, de l'activité enzymatique, de la composition et de la saccharification de la cellulose microcristalline. ( a ) Expression génique relative des principales cellulases et xylanases. La PCR en temps réel a été réalisée sur l'échantillon de culture de 48 h avec du glucose comme source de carbone. Les niveaux de transcription de l'ARN des souches pgk1 et E1AB1-X ont été mesurés pour le calcul de référence et la normalisation des données, respectivement, et analysés à l'aide de la méthode ΔΔCt. (b) L'activité volumétrique de chaque enzyme dans le surnageant de culture obtenu après 72 h de culture avec du glucose comme source de carbone. Une unité d'activité est définie comme la quantité d'enzyme qui a produit 1 μmol de p-nitrophénol par minute par ml de culture du surnageant du substrat à 50 °C. Les graphiques à barres montrent l'activité relative à E1AB1-X. (c) La concentration de chaque composant enzymatique a été calculée à partir de la composition enzymatique et de la concentration totale de protéines sécrétées. Les compositions ont été calculées à partir des modèles de bandes suivant SDS-PAGE (voir fichier supplémentaire Fig. S2) dérivés de E1AB1 (culture en utilisant de la cellulose : C et du glucose : G), E1AB1-X (G), E1AB1-A3 (G) et Souches E1AB1-XA3 (G). Les concentrations de protéines ont été déterminées à partir de la valeur de 96 h. ( d ) Saccharification de la cellulose microcristalline en utilisant le même dosage de protéines (2,0 mg de protéines / g de cellulose). (e) Saccharification de la cellulose microcristalline en utilisant le même volume de surnageant de culture (0,87 ml de surnageant de culture/g de cellulose). Les barres d'erreur indiquent les écarts types. La signification statistique a été déterminée par un test t de Student bilatéral non apparié. **p < 0,01, *p < 0,05.

La saccharification de la cellulose microcristalline a été évaluée à l'aide d'enzymes produites dans des conditions inductrices à l'aide de cellulose ou dans des conditions non inductrices à l'aide de glucose. Dans l'évaluation utilisant 2,0 mg d'enzyme par g de cellulose, l'enzyme produite par la souche parentale E1AB1 induite avec de la cellulose a libéré la plus grande quantité de glucose à 26,8 g de glucose/L. En revanche, l'enzyme produite par la souche E1AB1-XA3 était la meilleure dans la condition non inductrice avec 22, 5 g-glucose / L (Fig. 4d). L'enzyme de la souche E1AB1-A3 a libéré 17,8 g-glucose/L. Ce résultat était 2, 3 fois supérieur à celui de l'enzyme de la souche E1AB1-X (Fig. 4d). Nous en avons déduit que cela était peut-être dû au rapport de composition élevé des composants de la cellulase dans la protéine. Cependant, comme décrit ci-dessus, la quantité totale d'enzymes sécrétées produites par la souche E1AB1-A3 était de 0,57 g/L (Fig. 4c) et la quantité absolue de cellulase était de 0,34 g/L. En revanche, le cocktail enzymatique dérivé de la souche E1AB1-X contenait une concentration en protéines de 2,09 g/L et était plus productif que E1AB1-A3, mais il était principalement composé de xylanases ; en conséquence, la quantité absolue de cellulases était de 0,24 g/L. Par conséquent, la composante cellulase produite par les souches E1AB1-A3 et E1AB1-X était inférieure à celle de la souche E1AB1-XA3, 1,25 g/L. Par conséquent, la saccharification a été réalisée en utilisant 0,87 ml du même volume de surnageant de culture. Les résultats ont montré que l'enzyme de la souche E1AB1-A3 libérait 6,5 g-glucose/L, et l'enzyme de la souche E1AB1-X libérait 7,5 g-glucose/L, les deux enzymes ayant des performances comparables. En revanche, l'enzyme de la souche E1AB1-XA3 a libéré une quantité significativement plus élevée, 19,9 g-glucose/L (Fig. 4e). Cela suggère que la souche E1AB1-XA3 peut produire une meilleure enzyme que la souche de surexpression XYR1V821F existante dans des conditions sans inducteur.

La souche E1AB1-XA3 s'est avérée avoir deux phénotypes importants : un rapport de composition de cellulase accru par l'expression constitutive d'ACE3 et une productivité protéique élevée dans des conditions non inductrices en introduisant XYR1V821F muté. Ainsi, nous pourrions obtenir la propriété la plus cruciale de l'enzyme cellulolytique, qui est la production accrue de cellulase dans un système de production non inducteur.

Le système de production d'enzymes sans inducteur précédemment rapporté par T. reesei utilisant XYR1V821F ou XYR1A824V muté produisait principalement de la xylanase, avec une faible activation de l'expression de la cellulase32,33. Par conséquent, nous avons développé une stratégie de modification génétique pour produire à la fois de la cellulase et de la xylanase au même niveau que dans les conditions induites. En conséquence, nous avons pu générer avec succès de grandes quantités de cellulase et de xylanase sans inducteurs. Productivité améliorée de la cellulase en utilisant le glucose comme seule source de carbone a été obtenue par l'expression constitutive de XYR1V821F ou XYR1A824V et ACE3 mutés, en particulier ACE3, ayant un domaine de liaison à l'ADN partiellement tronqué.

Dans ce rapport, la co-expression de XYR1V821F avec des facteurs liés à la régulation de la cellulase, CRT1, BGLR, VIB1 ou ACE2, n'a pas augmenté l'expression de la cellulase (Fig. 2). Auparavant, il a été rapporté que la suppression de ces facteurs entraînait une perte ou une réduction de l'expression de la cellulase38,39,40,45. Ces facteurs ont également été affectés par une expression accrue de XYR1 et ACE3 (par exemple, crt1 est régulé par ACE338,47). Cela suggère que l'effet de la co-expression de XYR1V821F avec ces facteurs peut ne pas s'être produit car des quantités suffisantes de ces facteurs étaient déjà régulées à la hausse par l'expression constitutive de XYR1V821F muté et la régulation à la hausse ultérieure d'ACE3 (Fig. 3e, voie n ° 3). En revanche, il a été observé que l'effet de la co-expression d'ACE3 contribue à l'amélioration de la production de cellulase (Fig. 2), ce qui suggère qu'il est nécessaire d'améliorer l'expression d'ACE3 au-delà de la régulation positive par XYR1V821F muté. Il a été rapporté précédemment que l'ACE4 se lie directement au promoteur ace3 et régule l'expression de l'ACE3 pour favoriser la production de cellulase56. Il est possible qu'ACE3 soit régulé non seulement par XYR1 mais également par d'autres facteurs, y compris ACE4, ce qui suggère qu'une expression accrue d'ACE3 par des facteurs autres que XYR1 pourrait être la clé de l'expression de la cellulase. En plus de la régulation de l'expression principale de la cellulase/hémicellulase, il est également possible que des enzymes mineures (non sous le contrôle de XYR1 et ACE3) n'aient pas été exprimées, et une analyse plus approfondie du profil d'expression de divers régulateurs et familles de glycosides hydrolases nécessite une intervention future.

XYR1 a été étudié comme l'un des principaux régulateurs de la production de cellulase et de xylanase, mais son mécanisme de régulation détaillé reste incertain. Dans notre étude, la co-expression de XYR1 de type sauvage et de PT-ACE3 (souche E1AB1-XwtAnhr) n'a pas montré d'augmentation de la productivité de la cellulase par rapport au PT-ACE3 exprimant de manière constitutive (souche E1AB1-A3) (Fig. 3). De plus, dans une souche industrielle dérivée de Rut-C30, la production de cellulase n'a pas augmenté en l'absence d'inducteurs de cellulase lors du remplacement du promoteur xyr1 natif par des promoteurs constitutifs, tels que les promoteurs de la phosphoglycérate kinase, de l'histone 3 et du facteur de transcription basic-leucine zipper. gènes12. En revanche, la surexpression de XYR1 de type sauvage à l'aide du promoteur répressible au cuivre Ptcu1 dans la souche T. reesei QM9414 a entraîné une production élevée de cellulase dans des cultures enrichies en glucose57. Bien que le promoteur act1 ait été sélectionné comme promoteur exprimé de manière constitutive dans cette étude, il aurait pu être insuffisant pour améliorer le niveau d'expression de xyr1 de type sauvage, et peut-être que la cellulase pourrait être induite par la surexpression de XYR1 de type sauvage. En revanche, l'expression de xyr1V821F muté à l'aide du même promoteur act1 a conduit à une production remarquable de xylanase dans des conditions non inductrices (Fig. 1). Il est également suggéré qu'une modification post-traductionnelle de XYR1 peut être nécessaire pour une activation complète de la transcription des gènes de la cellulase et de l'hémicellulase12. Des mutations dans le domaine d'activation acide de XYR1, telles que A824V ou V821F, pourraient imiter les modifications post-traductionnelles et activer au moins l'expression de la xylanase à des niveaux inférieurs à ceux de XYR1 de type sauvage. Par conséquent, il a été suggéré que les profils d'expression de la cellulase / hémicellulase sont différents même en utilisant la même force de promoteur dans XYR1 de type sauvage et muté, et une enquête plus approfondie est nécessaire pour déterminer si le niveau d'expression de XYR1V821F muté était optimal dans cette étude et le effet de la force du promoteur sur la conduite du XYR1 de type sauvage/muté.

Il a été démontré qu'un autre facteur de modification, ACE3, joue un rôle important dans la régulation de la cellulase, mais son analyse fonctionnelle reste incertaine. L'ACE3 dans T. reesei NG14 et les souches RUT-C30 et RL-P37 dérivées ont une troncature de 11 acides aminés à l'extrémité C-terminale, ce qui entraîne une productivité de cellulase plus élevée42. De plus, Luo et al. ont rapporté une production élevée de cellulase même dans des conditions sans inducteur par surexpression d'ACE3 avec une troncature C-terminale de 7 à 17 acides aminés, en utilisant la souche RL-P37 comme souche mère43. Dans ce système rapporté, aucun des ace3 n'avait une extrémité C-terminale complète de type sauvage43. En revanche, dans cette étude, dans la souche E1AB1 dérivée de la souche PC-3–7, ace3 dans le génome avait une extrémité C-terminale complète et ace3 avec une expression encore améliorée n'avait aucune mutation C-terminale. Cependant, une production élevée de cellulase a été obtenue dans des conditions non inductrices par co-expression avec XYR1V821F muté (Fig. 3a). Luo et al. ont suggéré que les 17 acides aminés C-terminaux de l'ACE3 peuvent être soit le domaine répresseur lui-même, soit une partie d'un domaine qui interagit avec le répresseur43. Nos résultats ont indiqué que la mutation C-terminale d'ACE3 n'est pas essentielle pour la production de cellulase sans inducteur et que son interaction avec XYR1V821F muté peut libérer directement ou indirectement sa fonction inhibitrice à l'extrémité C-terminale d'ACE3.

De plus, Luo et al. ont rapporté qu'un domaine de liaison à l'ADN de type Zn (II) 2Cys6 avec les six cystéines à l'extrémité N-terminale et une mutation spécifique à l'extrémité C-terminale étaient nécessaires pour la production de cellulase sans inducteur43. En revanche, dans la présente étude, l'expression de FL-ACE3 avec un domaine de liaison à l'ADN N-terminal complet a amélioré la productivité de la cellulase. Cependant, étonnamment, PT-ACE3 avec un domaine de liaison à l'ADN incomplet était plus productif (Fig. 3). ACE3 a été proposé pour former des homodimères avec ACE3 et des hétérodimères avec XYR141, et exprimer de manière constitutive PT-ACE3 qui peut interagir avec natif-ACE3 (ayant un domaine de liaison à l'ADN complet), PT-ACE3, natif-XYR1 ou muté XYR1V821F. De plus, les niveaux de transcrits de FL-ace3 n'ont pas augmenté de manière significative dans des conditions induites utilisant de la cellulose, et les transcrits correspondant principalement à PT-ace3 ont augmenté (Fig. 3e, voie 1), confirmant les rapports précédents43. Par conséquent, ACE3 avec une capacité de liaison à l'ADN est nécessaire pour l'expression de la cellulase, mais pas nécessairement pour augmenter le niveau d'expression. Il a été considéré que l'ACE3 correspondant à PT-ACE3 régule l'expression de la cellulase par la formation de dimères et les interactions avec d'autres facteurs également lors de la production de cellulase avec des inducteurs. Le domaine de liaison à l'ADN d'ACE3 est classé comme un cluster binucléaire Zn(II)2Cys6 de type Gal4 ; Gal4 est connu pour se lier à l'ADN sous forme d'homodimère58. Par conséquent, on a émis l'hypothèse que les homodimères avec PT-ACE3 (avec PT-ACE3 ou FL-ACE3 natif), dans lesquels une partie du domaine de liaison à l'ADN était tronquée, perdaient leur capacité de liaison à l'ADN. Cependant, les résultats de la co-expression et des régions de transcription accrue lors de la production induite sur la figure 3e suggèrent que la présence de PT-ACE3 régule positivement la production de cellulase. Par conséquent, la liaison à l'ADN de l'ACE3 peut également jouer un rôle dans l'inhibition, selon l'état. On a également pensé que l'hétéromérisation avec XYR1, qui peut se lier à l'ADN, pourrait activer la production de cellulase, mais une enquête plus approfondie sur la fonction d'ACE3 avec troncature partielle du domaine de liaison à l'ADN serait nécessaire.

Les locus ace125 et rce126 utilisés pour insérer xyr1V821F et d'autres facteurs liés à la régulation de la cellulase étaient des répresseurs connus. Dans cette étude, leur perturbation n'était pas essentielle et n'a pas contribué à l'amélioration de la composition de la cellulase, bien que la concentration totale de protéines sécrétées ait été augmentée (Fig. 3b, c). La productivité enzymatique de la souche E1AB1-XA3 utilisant du glucose a été améliorée par rapport aux souches E1AB1-X et E1AB1-A3 mais légèrement inférieure à la souche mère E1AB1 utilisant de la cellulose (Figs. 1a, 3c, 4c). Cela semblait dépendre en grande partie de la propriété de la cellulose en tant que source de carbone et de son inductibilité. Le glucose est extrêmement facile à assimiler et se consomme rapidement ; par conséquent, il a été épuisé après 48 h dans cette étude (fichier supplémentaire Fig. S3). En revanche, la cellulose n'est pas facilement assimilée et se dégrade lentement, libérant du cellobiose et du glucose sur une longue période, et elle est considérée comme moins susceptible d'induire une RCC. La souche E1AB1 utilisée dans cette étude est une souche industrielle qui a subi une reproduction par mutations répétées, et la mutation cre150 et la perturbation de l'α-tubuline (tubB)54 ont éliminé diverses réglementations suppressives, y compris le CCR. Cependant, même dans cette souche, la production d'enzymes était faible, tandis que les concentrations de glucose étaient élevées (fichier supplémentaire Fig. S3). Luo et al.43 ont également mentionné que la production de (hémi)cellulase ne se produit qu'après que le glucose a été épuisé en dessous d'un certain seuil, et que le CCR n'a pas été complètement surmonté. Dans l'état actuel, les pratiques pour éviter le CCR (par exemple, la culture fed-batch59,60) sont nécessaires pour conduire à une productivité élevée de la cellulase équivalente aux cultures utilisant de la cellulose, et l'expression constitutive d'activateurs tels que XYR1 et ACE3 ne peut à elle seule surmonter le CCR . Par conséquent, une étude plus approfondie des mécanismes de répression est nécessaire en plus de la modification de ces activateurs.

En raison de sa grande capacité de production, T. reesei est un hôte prometteur pour la production de protéines hétérologues. Cependant, l'utilisation du système conventionnel de production d'enzymes à base de cellulose est difficile pour la production de protéines hétérologues61,62. Si les gènes de cellulase sont remplacés par des gènes pour les protéines d'intérêt, la cellulose ne peut pas être décomposée et l'inducteur n'est pas libéré, ce qui diminue la capacité de production de protéines. Au contraire, si la cellulase n'est pas perturbée, de grandes quantités de cellulases natives seront contaminées62. Des rapports antérieurs ont montré la production de protéines hétérologues en utilisant les promoteurs xyn1 et xyn2 avec xyr1A824V63. Cependant, les résultats de cette étude indiquent qu'il est devenu possible d'utiliser des promoteurs de cellulase extrêmement puissants, tels que cbh1 et cbh2, pour la production de protéines hétérologues sans coproduction de cellulase. On s'attend à ce que ces promoteurs de cellulase puissants soient d'excellents outils de productivité pouvant être utilisés pour exprimer des enzymes saccharifiantes pour la production de bioéthanol et diverses protéines précieuses.

Les souches de T. reesei utilisées dans cette enquête sont répertoriées dans le tableau 1. Les souches de T. reesei E1AB153 et E1AB1Δpyr4 (uracil auxotroph) ont été gracieusement fournies par le professeur W. Ogasawara (Nagaoka University of Technology). Les souches ont été maintenues sur des plaques de gélose au dextrose de pomme de terre (PDA; Difco Laboratories, Detroit, MI).

Pour la production d'enzymes en préculture, 4 × 105 spores de chaque souche ont été inoculées dans 2 mL de milieu de base48 contenant 1 % (p/v) de glucose dans un tube de culture de 10 mL. Les spores ont été comptées en utilisant un hémocytomètre Thoma (Sunlead Glass Corp.). Le milieu de base comprenait 0,14 % (p/v) (NH4)2SO4, 0,2 % (p/v) KH2PO4, 0,03 % (p/v) CaCl2·2H2O, 0,03 % (p/v) MgSO4 7H2O, 0,1 % (p/v) /v) polypeptone, 0,05 % (p/v) d'extrait de levure, 0,1 % (p/v) de Tween 80 et une solution d'oligo-éléments à 0,1 % (p/v) dans un tampon Na-tartrate 50 mM (pH 4,0). La solution d'oligoéléments contenait 6 mg de H3BO3, 26 mg de (NH4)6Mo7O24·4H2O, 100 mg de FeCl3·6H2O, 40 mg de CuSO4·5H2O, 8 mg de MnCl2·4H2O et 200 mg de ZnCl2 dans 100 ml d'eau distillée. La préculture a été réalisée par agitation à 220 rpm, à 28°C pendant 2 jours. Pour chacune des cultures principales, 500 μL de la préculture ont été inoculés dans 50 mL de milieu de base contenant 3 % (w/v) de cellulose en poudre (KC FLOCK W-400G, Nippon Paper Industries) ou du glucose et 1,28 % (w/v ) de l'hydrogénocitrate de diammonium dans un erlenmeyer de 500 mL. La culture principale a été secouée à 220 tr/min à 28 °C pendant 3 à 5 jours. Pour l'échantillonnage, les cellules ont été retirées du bouillon de culture par centrifugation à 16 000 g pendant 5 min, et le surnageant a été filtré à travers un filtre à membrane en acétate de cellulose de 0, 20 μm (13CP020AN; Advantec, Toyo Roshi Kaisha). Toutes les expériences ont été réalisées en triple.

Les gènes d'intérêt ont été amplifiés à partir de l'ADN génomique de la souche PC-3–7 de T. reesei et un fragment de vecteur a été amplifié par réaction en chaîne par polymérase inverse (PCR) en utilisant pUC118 (Takara Bio) comme matrice. Les fragments amplifiés, conçus à l'aide d'amorces qui ont ajouté un site de clivage SwaI, ont été ligaturés à l'aide d'un kit de clonage HD In-Fusion (Clontech) selon le protocole du fabricant. Escherichia coli DH5a a été utilisé comme hôte de clonage et un kit de miniprep NucleoSpin® Plasmid (Takara Bio) a été utilisé pour purifier l'ADN plasmidique. Plus de détails sur le gène cloné et les amorces sont fournis dans le fichier supplémentaire, tableau S5. Le fragment de vecteur pUC-K017 a été généré par PCR inverse ; il était dérivé du plasmide inséré ace1 ligaturé (pUC-K003) et de la cassette de marqueur pyr4 (pUC-K016). Un fragment de PCR inverse de la construction de perturbation ace1 (pUC-K017) et des fragments du promoteur act1, xyr1 et du terminateur cbh1 ont été ligaturés pour générer le plasmide ΔAce1-Pact1-xyr1-pyr4 (pUC-K019). En utilisant ce plasmide comme matrice, une PCR inverse a été réalisée pour muter la valine en phénylalanine en position 821 pour obtenir ΔAce1-Pact1-xyr1V821F-pyr4 (pUC-K020) et pour muter l'alanine en valine en position 824 pour obtenir ΔAce1-Pact1-xyr1A824V- pyr4 (pUC-K021). De la même manière, un fragment de PCR inverse de la construction de perturbation rce1 (pUC-K018) et des fragments du promoteur act1, des ORF (crt1, bglr, vib1, ace2, PT-ace3, FL-ace3) et le terminateur cbh1 ont été ligaturé pour générer les plasmides pUC-K022, pUC-K023, pUC-K024, pUC-K025, pUC-K026 et pUC-K027, respectivement. Pour PT-ace3 et FL-ace3, pUC-K010 a été utilisé comme matrice pour concevoir une amorce directe basée sur les deux types de codons d'initiation putatifs. Plus de détails sur la construction de vecteurs et les amorces utilisées sont fournis dans le fichier supplémentaire, tableau S6.

Les plasmides ont été linéarisés avec SwaI avant la transformation de T. reesei, ou le produit de PCR a été transformé à l'aide d'une méthode protoplaste-PEG modifiée64, dans laquelle 20 mg/mL de Yatalase (Takara Bio) ont été utilisés comme enzyme protoplastique au lieu de Novozyme 234 (Novozymes Bagsværd, Danemark). Les protoplastes transformés ont été étalés sur un milieu de transformation minimal [2,0 % (p/v) glucose, 18,27 % (p/v) sorbitol, 0,5 % (p/v) (NH4)2SO4, 0,2 % (p/v) CaCl2, 0,06 % (w/v) MgSO4, 0,21 % (w/v) CsCl et 0,1 % (w/v) solution d'oligoéléments dans un tampon KH2PO4 100 mM (pH 5,5)] pour le marqueur pyr4. La solution d'oligoéléments contenait 500 mg de FeSO4·7H2O, 200 mg de CoCl2, 160 mg de MnSO4·H2O et 140 mg de ZnSO4·7H2O dans 100 ml d'eau distillée. Après deux semaines d'incubation à 30 ° C, les transformants candidats ont été striés deux fois sur des plaques sélectives (chaque milieu de transformation minimal sans sorbitol) pendant plusieurs jours à 30 ° C pour l'isolement d'une seule colonie. Des colonies individuelles ont ensuite été transférées sur des plaques PDA pendant une semaine à 30 ° C pour permettre la formation de conidies. Selon le protocole du fabricant, un transformant a été confirmé par PCR sur colonie en utilisant KOD One (Toyobo). Pour transformer à nouveau les transformants résultants en utilisant le milieu PDA contenant 0,2 % (p/v) de monohydrate d'acide 5-fluoroorotique (5-FOA), une souche qui a acquis à nouveau la résistance au 5-FOA (pyr4 pop-out par recombinaison homologue) a été sélectionnée.

Selon le protocole du fabricant, la concentration en protéines a été déterminée à l'aide du dosage des protéines de Bradford (Bio-Rad) avec de la gamma-globuline bovine comme étalon. La concentration en glucose dans le surnageant a été quantifiée à l'aide du kit Glucose CII Test Wako (Wako Chemicals). Plus précisément, 150 μL de la solution réactionnelle ont été ajoutés à 1 μL des surnageants dilués dans une plaque à 96 puits, bien mélangés et incubés à température ambiante pendant 15 min. L'absorbance de tous les échantillons et étalons a été mesurée à 505 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques (Molecular Devices).

Le culot cellulaire à 48 h, recueilli par centrifugation, a été légèrement essoré et congelé dans de l'azote liquide. Un cône métallique a été placé dans l'échantillon congelé avant le broyage avec un Multi-Beads Shocker (Yasui Kikai Corp.) à 1700 tr/min pendant 10 s, et l'extraction de l'ARN a ensuite été effectuée à l'aide du RNeasy Mini Kit (Qiagen), selon les instructions du fabricant. protocole. La digestion de l'ADNg et la synthèse de l'ADNc ont été réalisées à l'aide de l'enzyme ezDNase™ (Invitrogen) et du Master Mix SuperScript™ IV VILO™ (Invitrogen), respectivement. Des expériences de RT-qPCR ont été réalisées avec des mélanges maîtres Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR (Agilent), et les niveaux de transcription ont été évalués à l'aide de la méthode ΔΔCt en utilisant le gène pgk1 comme normalisateur et E1AB1 (Fig. 3d, e) ou E1AB1-X (Fig. 4a) souche comme calibrateur. Tous les échantillons ont été analysés dans au moins trois expériences biologiques indépendantes. Les amorces utilisées pour la PCR en temps réel ont été conçues à l'aide de Primer3 (https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) et sont répertoriées dans le fichier supplémentaire Tableau S4.

La SDS-PAGE a été réalisée à l'aide de gels de protéines préfabriqués Any kD Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad) pendant 35 min à 200 V. Le gel a été activé pendant 5 min et imagé à l'aide du système d'imagerie ChemiDoc MP (Bio-Rad). Precision Plus Protein Unstained Standard (5 μL; Bio-Rad) a été utilisé comme marqueur de masse moléculaire. Sauf indication contraire, 2,5 μg de protéine ont été chargés dans chaque puits. Les gels ont été recadrés dans la plage de 15 à 250 kDa car aucune bande claire n'a été détectée sous 15 kDa (le gel original des Figs. 1b, 2b et 3b a été présenté sur les Fig. S4, S5 et S6 voir Fichier supplémentaire). Le poids moléculaire des bandes protéiques a été estimé à l'aide du logiciel Image Lab (BiFio-Rad) et les bandes protéiques ont été annotées en utilisant les positions correspondant aux cellulases et xylanases précédemment signalées53. L'identification des protéines à l'aide de systèmes nano LC-MS/MS a été réalisée par Japan Proteomics Co. LTD.

Les activités enzymatiques de la cellobiohydrolase, de la β-glucosidase, de la xylanase et de la β-xylosidase ont été mesurées à l'aide des substrats p-nitrophényl-β-d-lactoside (pNPL), p-nitrophényl-β-d-glucopyranoside (pNPG), p-nitrophényl -β-xylobioside (pNPX2) et p-nitrophényl-β-d-xylopyranoside (pNPX), respectivement. Les réactions ont été réalisées dans de l'acétate de sodium 50 mM à pH 5,0 et 50 °C pendant 10 min et terminées par l'ajout d'un volume de Na2CO3 1 M. Le p-nitrophénol libéré a été quantifié en mesurant l'absorbance à 420 nm. Une unité d'activité est définie comme la quantité d'enzyme qui a produit 1 μmol de p-nitrophénol par minute à 50 °C. La saccharification de la cellulose a été réalisée à l'échelle de 1 ml dans des flacons en verre à bouchon vissé de 9 ml à une charge de 5 % (p/v) de cellulose microcristalline (Avicel® PH-101, Sigma-Aldrich) dans un tampon d'acétate de sodium pH 100 mM. 5,0, en utilisant une charge enzymatique de 2,0 mg de protéine/g de cellulose. La concentration en protéines a été déterminée comme mentionné ci-dessus. La réaction a été effectuée à 50 °C sous agitation à 150 tr/min pendant 72 h. Les échantillons obtenus après saccharification ont été filtrés (0,2 μm) et la concentration en glucose a été mesurée à l'aide d'un dosage enzymatique et d'un Multifunction Biosensor BF-7 (Oji Scientific Instruments), selon le protocole du fabricant.

Toutes les expériences ont été réalisées avec au moins trois échantillons indépendants. Les barres d'erreur indiquent l'écart type (SD) de la moyenne des triplicats. La signification statistique a été déterminée par le test t de Student bilatéral non apparié. Dans chaque ensemble d'expériences, p < 0,05 a été considéré comme significatif.

Les séquences de protéines et de nucléotides utilisées dans cette étude peuvent être référencées à partir d'Uniprot sous les ID d'accession suivants : ACE1_G0RCC6, RCE1_G0RBV8, XYR1_G0RLE8, CRT1_G0RGH7, BGLR_G0RVU2, VIB1_G0R8Z5, ACE2_G0RKV9, ACE3 (partiellement tronqué)_G0RIA0, ACE3 (complet -longueur)_A0A5C1J077.

β-Glucosidase

β-xylosidase

Cellobiohydrolase

Répression des catabolites de carbone

Endoglucanase

Réaction en chaîne par polymérase

p-nitrophényl-β-d-glucopyranoside

p-nitrophényl-β-d-lactoside

p-nitrophényl-β-d-xylopyranoside

p-nitrophényl-β-xylobioside

Xylanase

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Les auteurs remercient le professeur Wataru Ogasawara de l'Université de technologie de Nagaoka pour avoir fourni la souche T. reesei E1AB1 et le professeur Ishii de l'Université de Kobe pour avoir approfondi notre réflexion en discutant de cette étude. Nous tenons à remercier Editage (www.editage.com) pour l'édition en anglais.

Recherche en sciences biologiques, Kao Corporation, 1334 Minato, Wakayama, Wakayama, 640‑8580, Japon

Toshiharu Arai, Sakurako Ichinose, Nozomu Shibata, Hiroshi Kakeshita, Hiroshi Kodama, Kazuaki Igarashi et Yasushi Takimura

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TA, SI et H.Ka. conçu l'étude; TA a analysé les résultats et rédigé le manuscrit ; SI a participé à la construction de souches et à l'analyse génétique ; H.Ka. révisé le manuscrit ; NS, H.Ka., H.Ko., KI et YT ont révisé et commenté le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Hiroshi Kakeshita.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Arai, T., Ichinose, S., Shibata, N. et al. Système de production de cellulase sans inducteur basé sur l'expression constitutive de XYR1 et ACE3 mutés dans le champignon industriel Trichoderma reesei. Sci Rep 12, 19445 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-23815-4

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Reçu : 23 avril 2022

Accepté : 07 novembre 2022

Publié: 14 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-23815-4

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