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Jun 18, 2023

Une méthode simple pour fabriquer, piéger et déformer une vésicule dans un gel

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 5375 (2023) Citer cet article

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Nous présentons une méthode simple pour produire des pseudo-vésicules lipidiques géantes (vésicules avec une coiffe huileuse sur le dessus), piégées dans un gel d'agarose. La méthode peut être mise en œuvre en utilisant uniquement une micropipette ordinaire et repose sur la formation d'une double gouttelette eau/huile/eau dans de l'agarose liquide. Nous caractérisons la vésicule produite par imagerie de fluorescence et établissons la présence et l'intégrité de la bicouche lipidique par l'insertion réussie de protéines transmembranaires \(\alpha\)-hémolysine. Enfin, nous montrons que la vésicule peut être facilement déformée mécaniquement, de manière non intrusive, en indentant la surface du gel.

Les vésicules ont été largement utilisées pour imiter la compartimentation cellulaire et reproduire des fonctions biologiques spécifiques in vitro avec des approches ascendantes1,2. Dans de nombreuses études récentes, l'accent a été mis sur l'encapsulation de réactions biologiques complexes à l'intérieur des vésicules, afin d'exprimer des protéines3 ou des gènes4, ou de reconstituer et étudier les filaments protéiques du cytosquelette, comme le cortex d'actine5 ou les asters microtubulaires6. De nombreux autres travaux visent à mimer les propriétés membranaires cellulaires, comme par exemple la fusion membranaire7,8,9, ou la communication cellulaire, via l'insertion de protéines transmembranaires dans des liposomes. En particulier, des canaux mécanosensibles10,11 ont été insérés dans la membrane des liposomes, permettant à leur tour de mesurer leur conductance sous contrainte mécanique.

La production de vésicules repose généralement sur des méthodes d'hydratation ou des modèles d'émulsion inversée. Les méthodes d'hydratation reposent sur le gonflement de films lipidiques séchés dans un tampon aqueux12,13. Ils sont relativement simples à utiliser mais donnent des tailles de vésicules polydispersées et une efficacité d'encapsulation relativement non homogène14,15,16. Le taux de production de vésicules unilamellaires peut être amélioré en utilisant des champs électriques (méthodes d'électroformation17) mais les protéines fragiles peuvent être endommagées par les champs appliqués18,19 et la technique est également limitée aux tampons à faibles concentrations ioniques. Les modèles d'émulsion inversée, quant à eux, sont basés sur le passage forcé de gouttelettes d'émulsion eau-dans-huile à travers une interface eau/huile5,20. Cette méthode peut être développée dans des puces microfluidiques21,22,23,24, produisant des tailles de vésicules monodisperses, qui sont limitées par les dimensions du canal microfluidique.

Dans les deux méthodes (hydratation ou émulsions), les vésicules résultantes sont dispersées dans le milieu extérieur, ce qui nécessite des étapes supplémentaires pour les manipuler ou les transférer dans différents environnements (micropipettes25, piégeage optique26, etc.). Ces étapes supplémentaires, reposant sur des compétences techniques spécifiques, rendent difficile la reproduction de nombreuses expériences et la collecte de statistiques importantes sur les propriétés des systèmes. En particulier, pour étudier les processus de mécanotransduction, il est nécessaire de stimuler mécaniquement les vésicules. En pratique, cela a généralement été réalisé avec des déformations locales de la membrane (aspiration de la pipette27, écoulements de fluide28,29, AFM30,31). Cependant, ces méthodes ne reproduisent pas fidèlement la nature des perturbations mécaniques dans les tissus. De plus, ils négligent le couplage mécanique entre les cellules et leur environnement visco-élastique biologique.

Nous proposons ici une nouvelle technique, qui fournit une plate-forme polyvalente pour la production simple de pseudo-vésicules biomimétiques (une vésicule avec un capuchon huileux sur le dessus), mais permet également leur piégeage et leur excitation mécanique non intrusive.

(a–f) (rangée supérieure) Esquisse de la méthode de production de la double émulsion. Les couleurs vert/orange/bleu représentent respectivement les phases interne/huile/externe. (rangée du bas) Images en fond clair. Barres d'échelle = 500 \(\mu \)m. La double gouttelette d'émulsion produite dans (f) sédimente dans l'agarose liquide et finit par être piégée sous forme de gels d'agarose. Simultanément, la coquille d'huile environnante crème au sommet de la goutte et une bicouche lipidique est zippée sur la partie inférieure. Quelques minutes plus tard, la pseudo-vésicule s'est formée et est piégée dans le gel, comme esquissé en (g). Panneau du bas : image macroscopique en fluorescence d'une pseudo-vésicule chargée de carboxyfluorescéine piégée dans un gel d'agarose. Barre d'échelle = 200 \(\mu \)m.

Les vésicules sont produites à partir d'une eau en configuration de gouttelettes d'huile contenant des lipides, qui est formée dans une solution d'agarose liquide et chaude (des détails sur les produits chimiques peuvent être trouvés dans la section "Méthodes"). Nous prélevons d'abord un petit volume (environ 500 nL) de la phase aqueuse interne (Fig. 1a), à l'aide d'une micropipette de 2,5 \(\mu \)L (Eppendorf). Deuxièmement, nous déplaçons la pipette dans le récipient d'huile/lipides et en aspirons environ 50 nL (Fig. 1b), en tournant la molette de réglage de la micropipette pendant que la pointe est immergée dans l'huile. La pointe de la pipette contient ainsi un sandwich huile/eau. Enfin, nous déplaçons la pipette dans la solution d'agarose chaude (température \(T\approx 38\,^{\circ }C\), voir détails dans la section "Méthodes") où nous expulsons le sandwich huile/eau en tournant en arrière la molette de réglage de la micropipette. Au cours de cette phase d'expulsion, la phase huileuse se développe d'abord en une gouttelette dans l'agarose liquide (Fig. 1c), suivie de la phase aqueuse qui se développe à l'intérieur de celle-ci (Fig. 1d, e). Enfin, nous remontons rapidement la pipette dans l'air, ce qui détache la double gouttelette de la pointe en raison du frottement visqueux de la solution d'agarose (Fig. 1f).

Immédiatement après sa formation, la gouttelette d'eau interne est ainsi entourée d'une couche d'huile contenant des phospholipides. Ces lipides se redistribuent donc aux deux interfaces huile-eau, avec leurs têtes hydrophiles tournées vers la phase aqueuse interne d'un côté et vers la solution d'agarose de l'autre. Pendant que la solution d'agarose se refroidit, la double gouttelette sédimente lentement dans la solution d'agarose et finit par être piégée dans le gel formé. Au cours de ce processus de refroidissement, la couche d'huile de la double goutte se créme par gravité pour former un bouchon d'huile, tandis que les lipides stabilisant les anciennes interfaces huile / eau forment une bicouche lipidique sur la partie inférieure de la goutte (Fig. 1g). La double goutte devient une pseudo-vésicule. Cette méthode simple de micro-pipette donne des pseudo-vésicules d'un diamètre de 601 \(\pm 58 \mu \)m (N = 98). Des tailles plus petites peuvent être obtenues en utilisant des embouts plus petits et un micro-injecteur (voir la section "Méthodes"). Le taux de production de la méthode est d'environ 5 pseudo-vésicules par minute et le taux de réussite est globalement d'environ 30 %. Une fois piégée dans le gel, la pseudo-vésicule est stable pendant plusieurs heures et peut être conservée toute la nuit si la cuvette contenant le gel est scellée pour éviter l'évaporation. De plus, étant piégées dans le gel, les pseudo-vésicules peuvent être facilement observées au microscope, comme dans32.

Pour caractériser la pseudo-vésicule et sonder l'existence d'une bicouche lipidique, nous avons d'abord utilisé des marqueurs fluorescents dispersés à la fois dans la phase aqueuse interne (carboxyfluorescéine, longueur d'onde d'émission \(\lambda _c = 525\) nm, vert, voir section "Méthodes" ) et la phase huileuse (rouge du Nil, longueur d'onde d'émission \(\lambda _n = 636\) nm, rouge). La pseudo-vésicule est produite dans le gel d'agarose comme décrit ci-dessus, et ensuite imagée à l'aide d'un microscope confocal, avec un objectif 4x. Les images de fluorescence des canaux vert et rouge sont enregistrées (voir Fig. 2a), montrant que la phase aqueuse fluorescente est efficacement encapsulée dans la pseudo-vésicule. Deuxièmement, nous avons ajouté des lipides fluorescents verts (NBD-PC, 1% en poids) au mélange lipidique présent dans la phase huileuse marquée au rouge de Nil. Une image composite obtenue par microscopie confocale est présentée sur la figure 2b. Sur la Fig. 2c, nous traçons pour chaque canal les profils d'intensité radiale normalisés (\((I(r)-I(0))/(I_{\textrm{cap}}+I(0))\), où \ (I_{\textrm{cap}}\) est l'intensité dans le bouchon d'huile dans un canal donné. Ces profils révèlent une augmentation significative du signal fluorescent provenant des lipides à la frontière entre la phase aqueuse interne et le gel d'agarose externe Au contraire, il n'y a pas de signal de fluorescence détectable provenant de la phase huileuse, ce qui indique qu'il n'y a pas de couche d'huile mesurable dans la bicouche, à la résolution spatiale du microscope confocal et dans la limite de notre sensibilité d'imagerie par fluorescence. confirment que la phase interne est efficacement encapsulée dans une bicouche lipidique dépourvue de quantités significatives d'huile. Cela n'exclut pas la présence de traces d'huile à des échelles de longueur submicrométriques dans la bicouche, comme en témoignent les vésicules formées par un modèle d'émulsion. ont montré en 34 que de tels résidus d'huile dans la membrane n'altéraient pas de manière significative les propriétés mécaniques ni la fonctionnalité de la membrane. La tension de membrane \(\gamma _b\) peut être estimée à partir des angles de contact du bouchon d'huile avec les phases aqueuse et gélosée (voir Informations complémentaires) et donne \(\gamma _b = 4,15 \pm 0,33\) mN/m ( obtenue à partir de 13 images sur N=8 pseudo-vésicules), ce qui est beaucoup plus grand que les valeurs habituellement rapportées dans les vésicules lipidiques électroformées35,36, \(\gamma _b \sim 10^{-3}\) mN/m. Au contraire, notre valeur de tension membranaire se compare bien à celles obtenues dans les Droplet Interface Bilayers (DIBs) qui sont des bicouches lipidiques planes obtenues en mettant en contact deux gouttelettes aqueuses baignant dans un mélange huile+lipide (voir par exemple37,38,39). Dans les DIB, il existe également des interfaces eau/huile entourant la bicouche lipidique. La valeur élevée de \(\gamma _b\) que nous mesurons dans notre pseudo-vésicule est donc, comme dans les DIB, vraisemblablement due à la présence du bouchon d'huile qui épingle et étire la bicouche de part et d'autre.

Pour sonder davantage la présence d'une bicouche lipidique et sa fonctionnalité, nous avons inséré des protéines transmembranaires \(\alpha \)-hémolysine (\(\alpha \)HL) dans la bicouche lipidique. \(\alpha \)HL est un nanopore40 heptamère à travers lequel les molécules de carboxyfluorescéine peuvent diffuser41. Pratiquement, nous avons constaté que la dissolution directe des monomères \ (\ alpha \) HL dans la phase aqueuse interne diminuait la stabilité de la pseudo-vésicule, en raison d'une modification induite par les nanopores de la tension superficielle huile / eau (voir informations supplémentaires). Nous avons donc utilisé des petites vésicules unilamellaires (SUV) contenant des nanopores \(\alpha \)HL, principalement préparés (voir section "Méthodes") et dispersés dans la phase interne aqueuse fluorescente chargée en carboxyfluorescéine. La pseudo-vésicule est alors formée comme décrit ci-dessus, permettant aux SUV contenues dans la phase interne de fusionner avec la bicouche, comme montré précédemment en 42. Cette fusion permet à son tour l'insertion de canaux transmembranaires fonctionnels dans la bicouche lipidique43,44, \(\alpha \)HL dans notre cas (Fig. 2d). Sous un macroscope à épifluorescence, nous avons imagé la fuite de carboxyfluorescéine à travers la pseudo-vésicule en acquérant une image toutes les 4 minutes, pendant deux heures. Nous avons réalisé des expériences témoins en utilisant d'une part des SUV dépourvues de nanopores \(\alpha \)HL, et d'autre part des pseudo-vésicules préparées sans SUV ni \(\alpha \)HL. Par analyse d'image, nous avons mesuré l'intensité moyenne à l'intérieur (resp. à l'extérieur) de la pseudo-vésicule \(I_{in}\) (resp. \(I_{out}\)) à partir de laquelle nous déterminons le contraste d'intensité de fluorescence \(\ Gamma = (I_{in}-I_{out})/(I_{in}+I_{out})\). La variation temporelle du contraste normalisé \(\Gamma (t) / \Gamma (t=0)\) est présentée sur la Fig. 2e. Clairement, le contraste normalisé diminue avec le temps pour les pseudo-vésicules contenant \(\alpha \)HL alors qu'il reste constant pour les pseudo-vésicules sans \(\alpha \)HL. Cela établit que la bicouche lipidique peut être fonctionnalisée avec une protéine transmembranaire. Plus quantitativement, en ajustant le contraste normalisé avec une décroissance exponentielle (ligne continue sur la Fig. 2e), nous obtenons un temps de relâchement caractéristique de \(5,9\pm 0,3~.10^4\) s. Cette échelle de temps devrait évoluer avec le volume de la vésicule45. Compte tenu de la grande taille de nos vésicules, nos résultats sont en bon accord avec les valeurs rapportées dans la littérature34,45,46.

(a) Image composite en microscopie confocale d'une pseudo-vésicule piégée dans un gel d'agarose. La phase interne contient de la carboxyfluorescéine (vert), tandis que la phase huileuse contient du rouge de Nil (rouge). ( b ) Image composite obtenue en ajoutant 1% en poids de NBD-PC fluorescent dans le mélange lipidique (vert) et une huile contenant du rouge de Nil (rouge). Couleur jaune = canaux rouge + vert. Pour plus de clarté, l'image a été lissée avec un filtre gaussien de rayon 2 pixels. Barres d'échelle = 200 \(\mu \)m. ( c ) Profil d'intensité de fluorescence radiale normalisé, moyenné sur N = 8 pseudo-vésicules marquées comme en ( b ). Les triangles verts (resp. disques rouges) montrent le canal des lipides fluorescents (resp. le canal des huiles fluorescentes). Les barres d'erreur sont SE des données. \(R=316\pm 24\) \(\mu \)m est la taille moyenne des pseudo-vésicules. ( d ) Esquisse de l'insertion de \ (\ alpha \) HL dans la membrane de la pseudo-vésicule, à l'aide d'un SUV chargé de \ (\ alpha \) HL. (e) Evolution temporelle du contraste normalisé \(\Gamma (t)/\Gamma (t=0)\), pour les pseudo-vésicules chargées \(\alpha \)HL (disques rouges, N=5) et expériences de contrôle sans \(\alpha \)HL (carrés noirs, N=5). Les barres d'erreur sont SD de données. La ligne continue est un ajustement exponentiel des données \(\Gamma (t)/\Gamma (t=0) = e^{-t/\tau } \approx 1-t/\tau \), avec \(\ tau = 5,9\pm 0,3~0,10^4 s\).

Étant donné que la pseudo-vésicule est piégée dans la masse du gel d'agarose, elle peut être déformée en indentant la surface du gel (Fig. 3a). On comprime la surface du gel avec un piston carré (surface S=1 \(\hbox {cm}^2\)) monté d'une platine de translation z motorisée (amplitude d'indentation, \(\Delta \)z = 1 mm , Fig. 3b–e), tout en mesurant la force normale appliquée F (section "Méthodes"). Avec notre macroscope à fluorescence, nous reproduisons une pseudo-vésicule contenant de la carboxyfluorescéine, car la pseudo-vésicule est déformée de manière cyclique (Fig. 3b – d). En utilisant l'analyse d'image, nous ajustons une ellipse à la forme de la pseudo-vésicule (en excluant le bouchon d'huile de l'analyse, Fig. 3c). Les variations temporelles des axes long a et court b de l'ellipse sont tracées sur la figure 3f, à partir de laquelle nous calculons l'excentricité de l'ellipse \(e = \sqrt{1-b^2/a^2}\). La variation de l'excentricité, \(\Delta e = e(F\ne 0)-e(F=0)\) peut être utilisée comme approximation de la déformation. Sur la Fig. 3g, nous traçons la contrainte de compression \(\sigma = F/S\) en fonction de e. On observe une relation linéaire, \(\sigma = K_e \Delta e\), avec un module de compression effectif de la pseudo-vésicule \(K_e = 12,1\pm 0,6\) kPa. La valeur de \(K_e\) est bien distincte du module de compression du gel \(K_{gel} \approx 85\) kPa (voir encadré de la Fig. 3g). De plus, nous avons réalisé des expériences complémentaires (voir Informations supplémentaires) montrant que la présence du bouchon d'huile n'affectait pas la déformation de la pseudo-vésicule. Notre méthode offre ainsi une plate-forme facile à utiliser pour étudier la mécanique des bicouches lipidiques ou les processus de mécanotransduction.

(a) Croquis de la configuration d'excitation mécanique. ( bd ) Images de fluorescence au macroscope de pseudo-vésicules détendues (( b ) Z = 0) ou déformées ( Z = 0, 5 et 1 mm dans ( c, d ), respectivement). En (c) la ligne rouge est l'ajustement du contour de la partie inférieure de la pseudo-vésicule avec une ellipse. Barre d'échelle = 400 \(\mu \)m. (e) Position du piston Z(t). ( f ) Axes majeur (rouge) et mineur (bleu) de l'ellipse ajustée en fonction du temps, pour une indentation cyclique longue de 1000 s. (g) Contrainte de compression \(\sigma \) en fonction de l'excentricité de l'ellipse e. Les croix grises correspondent à tous les points de données de (f), les cercles noirs sont des moyennes dans les bacs d'excentricité \(\delta e\)= 0,01. Les barres d'erreur sont SD des données. La ligne pointillée rouge est un ajustement linéaire aux données. En médaillon : Force normale en fonction de l'empreinte du piston. La droite est un ajustement linéaire \(F=\kappa z\), dont on peut déduire le module de compression du gel, \(K_{gel}=\kappa H/S\), avec H la hauteur du gel.

Globalement, notre approche constitue une méthode très simple pour produire et piéger des pseudo-vésicules au sein d'un gel, facile à mettre en place et peu coûteuse. D'une part, la méthode ne nécessite que de faibles volumes de phase encapsulée (\(\sim \) 1 \(\mu \)L d'échantillon), contrairement aux techniques usuelles de microfluidique21 qui nécessitent généralement des centaines de microlitres de solutions pour obtenir des débits stables. En revanche, elle repose sur une manipulation douce, évitant ainsi toute dénaturation des protéines pouvant être provoquée par l'application de champs électriques18,19 comme dans les techniques d'électroformation. Cela le rend particulièrement intéressant pour l'utilisation d'échantillons biologiques précieux et délicats. Notez, cependant, que la valeur estimée de la tension de la membrane dans notre système est beaucoup plus grande que les valeurs habituellement rapportées sur les vésicules électroformées, probablement en raison de la présence du bouchon d'huile qui épingle et étire la bicouche des deux côtés. Cet effet doit être pris en considération pour les applications ultérieures de la méthode. Enfin, du fait que les pseudo-vésicules sont piégées dans un gel, elles sont facilement localisées et ne nécessitent pas de manipulations post-production, contrairement aux méthodes de matrice d'émulsion. Les pseudo-vésicules peuvent également être facilement déformées en indentant la surface du gel, ce qui permet d'ajuster finement à la fois l'amplitude et la fréquence des contraintes. Enfin, les pseudo-vésicules sont noyées dans un gel viscoélastique qui mime mieux les propriétés mécaniques des tissus biologiques.

Sauf indication contraire, tous les produits chimiques ont été achetés auprès de Sigma Aldrich, Merk inc.

La phase aqueuse interne de la double gouttelette contient 10 mM de tampon Tris (pH = 7,5), 400 mM de saccharose et 100 mg/mL de dextran (\(\hbox {M}_w\)=40,10\(^3\) g/ mol,). Pour les pseudo-vésicules fluorescentes, nous avons ajouté 20 \(\mu \)M de carboxyfluorescéine à ce tampon. L'osmolarité de la phase interne, mesurée avec un osmomètre Löser TYP6 est d'environ 600 mOsm.

La phase externe est constituée d'agarose à basse température de gélification à 3% en poids, dissous dans un tampon contenant du Tris 10 mM (pH = 7,5) et du chlorure de potassium 200 mM. Avant l'ajout d'agarose, nous ajustons l'osmolarité à 380 mosm. L'agarose est ensuite dissous dans le tampon sur une plaque chauffante et la solution résultante est maintenue sous forme liquide à 85\(^\circ \)C.

La phase huileuse est un mélange 50/50 wt/wt d'hexadécane et d'huile de silicium AR20 dans lequel les lipides séchés sont dissous. Le mélange lipidique est celui décrit dans45 pour imiter la composition de la membrane bactérienne et maximiser sa stabilité dans les géométries bicouches d'interface de gouttelettes. Il se compose de 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC, 81,1% en poids%), de 1,2-diphytanoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DPhPC, 10,8% en poids%), de 1,2-dioléoyle -sn-glycéro-3-phospho-(1'-rac-glycérol) (sel de sodium) (DOPG, 5,4 % en poids) et cholestérol (2,7 % en poids). Notez qu'une concentration aussi élevée de DOPC empêche la formation de domaines lipidiques à la fois dans la bicouche47,48 et à l'interface huile/eau49. En pratique, on prépare une solution de 7,4 mg de ce mélange lipidique dissous dans du chloroforme. Les lipides sont ensuite séchés sous azote et conservés sous atmosphère inerte dans un flacon de 2 mL à -20\(^\circ \)C pendant plusieurs semaines. Immédiatement avant utilisation, nous ajoutons 2 mL de la phase huileuse pour obtenir une concentration totale de lipides de 3,7 mg/mL, et plaçons le flacon dans un bain à ultrasons pendant 30 minutes à 30 \(^\circ \)C. Ce mélange huile/lipide peut ensuite être utilisé pendant quelques jours.

Pour l'imagerie confocale, nous avons marqué séparément la phase huileuse et les phospholipides. La phase huileuse est marquée au rouge de Nil selon la procédure suivante : une petite quantité de rouge de Nil solide (généralement la pointe d'une spatule) est dissoute dans 300 \(\mu \)L d'acétone. 5 mL d'huile de silicone sont ensuite versés sur l'acétone et agités une nuit à température ambiante afin de transférer le colorant Nile Red dans la phase huile en évaporant toute trace de solvant.

Pour le marquage de la bicouche lipidique, des lipides fluorescents ont été incorporés dans le mélange lipidique en suivant la procédure mentionnée ci-dessus. Nous utilisons des lipides 1-Myristoyl-2-[12-[(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]dodécanoyl]-sn-Glycero-3-Phosphocholine ou NBD-PC qui sont excités à 480 nm, nous permettant d'imager simultanément la phase huileuse marquée au Nile Red et la bicouche lipidique marquée au NBD-PC. Dans ce cas, les concentrations finales de lipides dans le mélange donnent : 80,3 % en poids de DOPC, 10,7 % en poids de DPhPC, 2,7 % en poids de cholestérol, 5,4 % en poids de DOPG, 1 % en poids de NBD-PC.

Le mélange lipidique mentionné ci-dessus (masse lipidique totale 1,25 mg) est séché sous azote dans un tube à essai et laissé sécher davantage dans une chambre à vide pendant une nuit. Le lendemain, 1 ml de la phase aqueuse interne est ajouté au film lipidique et la solution est placée dans un sonicateur à sonde pendant 30 minutes en utilisant des cycles marche/arrêt de 15/5 secondes, respectivement.

Les monomères \(\alpha \)HL sont préparés dans le tampon aqueux interne à une concentration de 250 \(\mu \)g/mL. Afin d'obtenir des SUV décorés de nanopores \(\alpha \)HL, 30 \(\mu \)L de cette solution de \(\alpha \)HL ont été ajoutés à 120 \(\mu \)L de la solution de SUV, donnant une concentration finale de monomère dans les pores de 50 \(\mu \)g/mL. Le mélange résultant est incubé à température ambiante pendant environ une heure et utilisé comme phase interne des pseudo-vésicules.

Le sandwich huile/phase aqueuse est réalisé en suivant les étapes décrites dans le corps du texte. La solution d'agarose chaude est versée dans une cuvette de spectrophotomètre (dimensions 10x10x40 \(\hbox {mm}^{3}\)). La température de l'agarose est mesurée avec un thermocouple de température (USB-TC01, National Instrument). Lorsque la température atteint environ 38 °C, la double gouttelette se forme. Le système est laissé refroidir à température ambiante pendant environ 15 minutes, de sorte que l'agarose se gélifie autour de la pseudo-vésicule. Notez que la méthode peut en principe être utilisée dans des environnements liquides (sans agarose), ce qui permettrait d'utiliser des techniques d'élimination des bouchons d'huile comme décrit dans22,23,24. Dans nos premiers essais, cependant, les vitesses de sédimentation élevées des gouttelettes produites (qui étaient grandes et nettement plus denses que la phase externe) déstabilisaient les pseudo-vésicules lors de leur formation. Réduire la taille de la pseudo-vésicule (en utilisant un diamètre de pointe d'injection plus petit), ajuster la densité de la phase interne ou augmenter la viscosité de la phase externe réduira la vitesse de sédimentation de la double gouttelette produite et semble être une voie prometteuse pour obtenir des pseudo-vésicules stables en milieu liquide.

Pour les expériences d'excitation mécanique dans l'agarose, une fine feuille rectangulaire de plexiglas (largeur 1 mm) est ajoutée sur un côté de la cuvette pour recouvrir sa paroi, avant de couler l'agarose liquide. Pendant que l'agarose se gélifie, cette feuille est soigneusement retirée, laissant un espace vide entre le gel d'agarose et la paroi de la cuvette. En effet, du fait de l'effet de Poisson, une dilatation latérale du gel se produit lors de sa compression verticale. Cet espace vide est nécessaire pour permettre cette expansion latérale et une bonne déformation élastique du gel.

La cuvette est placée et fixée sur le dispositif représenté sur la Fig. 3a. Le piston a été imprimé en 3D pour s'adapter à la taille de la cuvette et une fine feuille de plexiglas est collée sur la face du piston en indentant la surface d'agarose. Le piston est monté sur un étage de translation commandé par un actionneur linéaire Newport LTA-HL (résolution Z de 1 \(\mu \)m). Au fur et à mesure que le piston creuse le gel, il dévie l'ensemble de deux porte-à-faux plans fixés à la base du porte-échantillon. Un capteur capacitif mesure la déflexion des porte-à-faux. Connaissant la raideur de ces porte-à-faux (de l'étalonnage précédent) on en déduit la force normale appliquée F (le bruit de mesure sur F est de 1 mN).

La première étape des expériences d'indentation consiste à déterminer la position de la surface du gel. A cet effet, la position Z du piston est abaissée par pas de 0,1 mm, tout en mesurant la force normale. Lorsque la force atteint 5 mN, la rampe est arrêtée et cette position Z est prise comme origine pour les coordonnées Z.

Par la suite, on impose une déformation cyclique des gels, en indentant le gel, à partir de cette position de surface, d'une valeur \(\Delta Z\), par pas de 100 \(\mu \)m. A chaque pas, la force est mesurée. La pseudo-vésicule est imagée à chaque étape d'indentation (à l'aide d'une impulsion de lumière bleue, durée 500 ms) avec un macroscope Leica et une caméra Pointgrey (BFLY-U3-23S6C-C).

Pour atteindre des tailles de pseudo-vésicules plus petites, nous utilisons une pointe d'injection plus petite. En pratique on utilise un tube Polyuréthane (Phymep) d'un diamètre extérieur de 240 \(\mu \)m et d'un diamètre intérieur de 130 \(\mu \)m. La tubulure est reliée à une seringue de 50 \(\mu \)L (Hamilton), montée sur un micro-injecteur de fabrication artisanale. Les pseudo-vésicules sont produites en gel d'agarose avec le tampon interne fluorescent et imagées par épifluorescence. Nous déterminons leurs tailles par analyse d'image et trouvons un diamètre moyen \(D= 410 \pm 45 \mu \)m (N=6). En principe, des tailles plus petites pourraient être obtenues en utilisant une pointe d'injection plus petite. La seule difficulté expérimentale consistera à former le sandwich huile/eau. L'utilisation d'un micro-injecteur commercial sera nécessaire.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses fichiers d'informations complémentaires. La correspondance et les demandes de données brutes et de matériaux doivent être adressées à EW ou L.-LP

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Les auteurs remercient Mathieu Letrou et Sophie Cribier pour leur aide précieuse à la préparation du SUV. EW reconnaît le soutien financier d'Emergence Sorbonne Université, LLP reconnaît le soutien de l'Agence Nationale de la Recherche (BOAT, ANR-17-CE30-0001) et d'Emergence(s) Ville de Paris.

Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Laboratoire Jean Perrin (LJP), 4 place Jussieu, 75005, Paris, France

Pierre Tapie, Alexis M. Prevost, Lorraine Montel, Léa-Laetitia Pontani & Elie Wandersman

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EW et LLP ont conçu le projet et les expériences, analysé les résultats et rédigé l'article, PT a collecté les données expérimentales, analysé les résultats et examiné le manuscrit. LM a participé à la collecte des données expérimentales, a analysé les résultats et a examiné le manuscrit. AP a participé au développement de la configuration expérimentale, a analysé les résultats et a examiné le manuscrit.

Correspondance à Léa-Laetitia Pontani ou Elie Wandersman.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Tapie, P., Prévost, AM, Montel, L. et al. Une méthode simple pour fabriquer, piéger et déformer une vésicule dans un gel. Sci Rep 13, 5375 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31996-9

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Reçu : 13 juillet 2022

Accepté : 21 mars 2023

Publié: 02 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-31996-9

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