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Apr 28, 2023

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Rapports scientifiques volume 12,

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 17209 (2022) Citer cet article

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Des milliards de cellules meurent chaque jour dans le corps et les particules de chromatine acellulaire (cfChP) qui en sont libérées pénètrent dans les compartiments extracellulaires du corps, y compris dans la circulation. Les cfChP sont connus pour pénétrer facilement dans les cellules saines pour endommager leur ADN et activer les voies apoptotiques et inflammatoires. Nous avons émis l'hypothèse que l'agression permanente des cellules saines par les cfChP est la cause sous-jacente du vieillissement et que le vieillissement pourrait être retardé en désactivant les cfChP extracellulaires. Ce dernier peut être effectué par des radicaux oxygène qui sont générés lors du mélange des nutraceutiques resvératrol et cuivre (R – Cu). La présente étude a examiné si l'administration prolongée de R–Cu retarderait les signes biologiques du vieillissement. Les souris C57Bl/6 ont été divisées en 3 groupes égaux ; un groupe a été sacrifié à l'âge de 3 mois, et qui a servi de jeunes témoins. Les souris restantes ont été laissées vieillir et, à l'âge de 10 mois, le groupe de vieillissement expérimental a reçu du R – Cu par gavage oral deux fois par jour pendant 12 mois supplémentaires à une dose de 1 mg/kg de R et 0,1 μg/kg de Cu. Le groupe témoin âgé a reçu de l'eau par gavage oral deux fois par jour pendant 12 mois. Les animaux des deux groupes ont été sacrifiés à l'âge de 22 mois. Le traitement R – Cu a entraîné la réduction de plusieurs caractéristiques biologiques du vieillissement dans les cellules cérébrales, notamment l'attrition des télomères, le dépôt d'amyloïde, les dommages à l'ADN, l'apoptose, l'inflammation, la sénescence, l'aneuploïdie et le dysfonctionnement mitochondrial. Le traitement R – Cu a également entraîné une réduction significative des taux sanguins de glucose, de cholestérol et de protéine C-réactive. Ces résultats suggèrent que les cfChP peuvent agir comme des instigateurs mondiaux du vieillissement et de la neurodégénérescence, et que l'utilisation thérapeutique du R-Cu peut aider à faire du vieillissement en bonne santé un objectif réalisable.

Avec l'augmentation progressive de la longévité, la race humaine est confrontée à une augmentation parallèle des troubles dégénératifs liés au vieillissement qui peuvent gravement compromettre la qualité de vie. Il est prévu qu'à l'échelle mondiale, le nombre de personnes âgées de 60 ans ou plus augmentera de 38 %, passant de 1 milliard à 1,4 milliard, dépassant le nombre de jeunes au cours des dix prochaines années1. L'Assemblée générale des Nations Unies a déclaré 2021-2030 Décennie du vieillissement en bonne santé, dans le but ultime de trouver des interventions thérapeutiques qui retarderont simultanément les nombreuses conditions associées au vieillissement1,2. Il est avancé que le vieillissement en bonne santé devrait être considéré comme la médecine préventive ultime3. Le vieillissement est caractérisé par une myriade de processus pathologiques qui conduisent à une détérioration progressive de la structure et de la fonction de toutes les cellules et tissus de l'organisme4, et est associé à une multitude de troubles dégénératifs tels que la maladie d'Alzheimer5, les maladies cardiovasculaires6, le diabète7 et le cancer8. Bien que de nombreuses théories du vieillissement aient été avancées9,10, aucune ne peut expliquer de manière exhaustive les nombreux changements qui accompagnent ce processus multidimensionnel.

Les dommages à l'ADN et l'inflammation chronique sont deux caractéristiques cardinales du vieillissement11,12. Dans ce contexte, nous avons signalé que les particules de chromatine acellulaires (cfChP) qui sont libérées par les milliards de cellules qui meurent chaque jour dans le corps et pénètrent dans les compartiments extracellulaires du corps peuvent être facilement internalisées par des cellules saines dans lesquelles ils infligent des cassures d'ADNdb, activent des voies apoptotiques et induisent des cytokines inflammatoires13,14. Cela nous a conduit à émettre l'hypothèse que l'agression répétée tout au long de la vie des cellules saines par les cfChP pourrait être la cause sous-jacente du vieillissement15,16. Notre groupe a réussi à isoler et à caractériser les cfChP du sérum humain qui, après examen EM, ont révélé une grande hétérogénéité de taille comprise entre ~ 10 et ~ 1000 nm13. Nous avons également signalé que les taux sanguins de cfChPs augmentent avec l'âge17.

Nos études précliniques ont conduit à l'identification d'une nouvelle combinaison pro-oxydante des nutraceutiques resvératrol (R) et cuivre (Cu) qui désactive les cfChP par l'intermédiaire de radicaux oxygène18,19,20. R est un antioxydant bien connu qui a fait l'objet de nombreuses recherches pour ses bienfaits pour la santé21. Cependant, et de manière surprenante, il agit comme un pro-oxydant en présence de Cu, qui est également un nutraceutique largement étudié22. Fukuhara et al.23 ont été les premiers à signaler que des radicaux oxygène sont générés lorsque R et Cu sont mélangés. Ils ont montré que R agit comme un catalyseur pour réduire Cu (II) en Cu (I) entraînant la génération de radicaux oxygène qui ont clivé le plasmide pBR322 DNA24. Nous avons étendu ces découvertes pour montrer qu'une combinaison de R et de Cu peut dégrader l'ADN génomique et l'ARN25, et peut désactiver les cfChP in vivo en dégradant leur composant ADN18,19,20,25. Nous avons en outre observé que, paradoxalement, l'activité de dégradation de l'ADN de R – Cu augmente à mesure que la concentration molaire de Cu diminue progressivement par rapport à R25. Sur la base de cette découverte, dans la présente étude, nous avons maintenu le rapport molaire de R: Cu à 1: 10–4.

Nous avons signalé qu'une combinaison de R et Cu, lorsqu'elle est utilisée à un rapport molaire de 1:10–4, a des effets thérapeutiques dans plusieurs conditions précliniques associées à des niveaux extracellulaires élevés de cfChPs18,19,20. Par exemple, le R-Cu administré par voie orale peut atténuer les effets secondaires toxiques de la chimiothérapie18 et de la radiothérapie19, et prévenir la tempête de cytokines induite par les endotoxines bactériennes et la mort chez la souris20. Nos premiers résultats suggèrent également que le R–Cu est thérapeutiquement efficace chez l'homme. Une étude observationnelle a montré que le R–Cu administré par voie orale à des patients atteints de Covid-19 sévère entraînait une réduction de la mortalité de près de 50 %26. Nous avons également rapporté que la mucosite de grade III-IV pouvait être significativement réduite par l'administration orale de R–Cu chez les patients recevant une chimiothérapie à haute dose et une greffe de moelle osseuse pour un myélome multiple27. Le traitement R – Cu a également entraîné une réduction significative des taux sanguins de cytokines inflammatoires dans cette étude.

Les radicaux d'oxygène qui sont générés lors de l'administration orale de R – Cu sont apparemment absorbés par l'estomac pour avoir des effets systémiques sous la forme de désactivation/éradication de cfChPs extracellulaire18,19,20,26,27. Dans la présente étude, nous avons tiré parti de la propriété de désactivation des cfChPs du R–Cu pour déterminer si l'administration prolongée de R–Cu à des souris vieillissantes retardera les caractéristiques du vieillissement et de la neurodégénérescence. La dose de R utilisée dans notre étude était de 1 mg/kg et celle de Cu était de 0,1 μg/kg, administrée par gavage oral deux fois par jour. Cette dose de Cu était 20 000 fois inférieure et celle de R 5 fois inférieure à celles qui ont été utilisées dans des études précliniques pour étudier leurs propriétés bénéfiques pour la santé par d'autres chercheurs28,29.

En utilisant la microscopie confocale et des anticorps contre l'ADN et l'histone, nous avons détecté une présence abondante de cfChP extracellulaires dans le cerveau de souris vieillissantes et observé que les cfChP étaient désactivés/éradiqués après une administration orale prolongée de R – Cu. La désactivation/éradication des cfChP a été associée à une régulation à la baisse de multiples signes biologiques du vieillissement dans les cellules cérébrales. Au niveau systémique, le traitement R – Cu a entraîné une réduction significative des taux sanguins de glucose, de cholestérol et de protéine C-réactive. Pris ensemble, nos résultats suggèrent que les cfChP agissent comme des instigateurs mondiaux du vieillissement et de la neurodégénérescence, et que l'utilisation thérapeutique du R-Cu peut aider à faire du vieillissement en bonne santé un objectif réalisable.

Le protocole expérimental de cette étude a été approuvé par le Comité institutionnel d'éthique animale (IAEC) du Centre avancé de traitement, de recherche et d'éducation sur le cancer (ACTREC), Tata Memorial Centre, Navi Mumbai, Inde sous l'autorisation n ° 16/2015. Les expériences ont été réalisées conformément aux directives de sécurité animale de l'IAEC et à celles des directives ARRIVE.

ACTREC-IAEC maintient un traitement, des soins et une utilisation respectueux des animaux dans la recherche scientifique. Il vise à ce que l'utilisation des animaux dans la recherche contribue à l'avancement des connaissances suivant les nécessités éthiques et scientifiques. Tous les scientifiques et techniciens impliqués dans cette étude ont suivi une formation sur la manipulation et la gestion éthiques des animaux sous la supervision d'un vétérinaire traitant certifié FELASA. Les animaux ont été euthanasiés à des moments appropriés sous atmosphère de CO2 par dislocation cervicale sous la supervision du personnel de l'animalerie formé par FELASA.

Les sources de R et de Cu étaient : le resvératrol (nom commercial—TransMaxTR, Biotivia LLC, États-Unis (https://www.biotivia.com/product/transmax/) ; le cuivre (nom commercial—Chelated Copper, JR Carlson Laboratories Inc. États-Unis (https://carlsonlabs.com/chelated-copper/).

Les souris consanguines C57Bl/6 obtenues auprès de l'animalerie institutionnelle ont été maintenues conformément aux normes de notre comité d'éthique animale institutionnelle. Ils ont été logés dans des cages exemptes d'agents pathogènes contenant une litière de balles sous un cycle lumière / obscurité de 12 h avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Le système CVC a été utilisé pour contrôler la température ambiante, l'humidité et la pression atmosphérique.

L'étude comprenait 24 souris C57Bl/6, dont 12 mâles et 12 femelles. Quatre souris de l'un ou l'autre sexe ont été sacrifiées à l'âge de 3 mois et ont servi de jeunes témoins. Les 16 souris restantes (8 mâles et 8 femelles) ont été laissées vieillir jusqu'à l'âge de 10 mois et divisées en deux groupes : (1) Souris témoins vieillissantes (N = 4 de chaque sexe) et (2) R–Cu traitées souris vieillissantes (N = 4 de chaque sexe). Les animaux des deux groupes ont été sacrifiés après 12 mois alors qu'ils avaient 22 mois.

R–Cu a été administré deux fois par jour par gavage oral pendant 12 mois (de 10 à 22 mois) à une dose de 1 mg/kg de R et 0,1 μg/kg de Cu. R, étant insoluble dans l'eau, a été administré sous forme de suspension aqueuse (100 μL) et Cu a été administré sous forme de solution à base d'eau (100 μL). Les souris témoins vieillissantes ont reçu de l'eau (100 μL) deux fois par jour par gavage oral. Nos études précédentes ont montré que cette dose de R–Cu est thérapeutiquement efficace dans plusieurs autres conditions précliniques18,19,20.

L'activité physique réduite et la perte de poids des souris ont été utilisées comme paramètres humains de l'étude et ont été notées deux fois par semaine. Aux moments appropriés comme indiqué ci-dessus, le sang a été prélevé par voie rétro-orbitaire sous anesthésie à l'isoflurane pour la séparation du sérum. Les animaux ont ensuite été euthanasiés sous atmosphère de CO2 par dislocation cervicale sous la supervision du personnel de l'animalerie formé par FELASA. Après l'euthanasie, le cerveau a été prélevé sur tous les animaux, fixé dans du formol à 10 % et des blocs de paraffine ont été préparés pour une analyse plus approfondie.

Les détails des sources commerciales et les numéros de catalogue des réactifs, des anticorps et des kits analytiques utilisés dans cette étude sont donnés dans le tableau supplémentaire 1.

L'expression de SOD dans les cellules cérébrales a été estimée à l'aide de la technique d'immunofluorescence (IF) décrite par nous plus tôt18,20. En bref, les sections FFPE ont été déparaffinées, réhydratées dans une série d'alcools, incubées dans un tampon citrate 0, 01 M (pH 6, 0) à 95 ° C pendant 20 min et lavées dans du PBS 1X. Les coupes ont été immuno-colorées en utilisant un anticorps primaire contre la SOD et un anticorps secondaire correspondant (suppl. Tableau 1). Les images ont été acquises et analysées à l'aide du logiciel FISH view version 8.1 (https://spectral-imaging.com, Applied Spectral Imaging, Israël).

L'activité SOD sérique a été mesurée par ELISA en utilisant un kit commercial (Cell Biolabs, CA, USA; cat no # STA 340) selon les instructions du fabricant.

Une coloration immunitaire pour l'ADN et l'histone H4 suivie d'une microscopie confocale a été réalisée sur des coupes de cerveau incluses dans la paraffine fixée au formol (FFPE) comme nous l'avons décrit en détail plus tôt20. L'intensité de fluorescence de cinq champs confocaux choisis au hasard (~ 50 cellules dans chaque champ) a été enregistrée et l'intensité de fluorescence moyenne (MFI) (± SEM) a été estimée.

La longueur moyenne des télomères du tissu cérébral a été estimée à l'aide d'une technique de PCR quantitative en temps réel très sensible (qRT-PCR)30,31. L'ADN génomique a été isolé du tissu cérébral à l'aide du kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Hilden, Allemagne). La quantification de l'ADN a été réalisée à l'aide d'un spectrophotomètre Nanodrop™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA). Dix nanogrammes d'ADN ont été utilisés dans 5 µl de 1 × SYBR Select Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 250 nM des deux amorces spécifiques aux télomères ou 350 nM d'amorces 36B4 pour un volume total de 10 µl de réactions. Les conditions de cyclage thermique pour les télomères et 36B4 sont les suivantes : dénaturation initiale de 95 °C pendant 10 min suivie de 40 cycles de 95 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s. La séquence pour les amorces sens et antisens spécifiques aux télomères (Sigma-Aldrich) est 5' CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT 3' & 5' GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT 3 '. Les séquences pour la phosphoprotéine ribosomale acide (36B4) - amorces sens et antisens spécifiques sont 5 'ACT GGT CTA GGA CCC GAG AAG 3' et 5'TCA ATG GTG CCT CTG GAG ATT 3', respectivement). L'ADN génomique isolé de la rate d'une souris individuelle a été utilisé comme ADN de référence et dilué en série pour le télomère et la PCR 36B4. Tous les échantillons ont été analysés en double sur un système de PCR en temps réel QuantStudio™ 12 K Flex (ThermoFisher) en utilisant un bloc de 384 puits. Des courbes standard ont été générées et la quantité d'entrée relative pour les télomères et 36B4 a été calculée. La moyenne du rapport des télomères et 36B4 a été rapportée comme la longueur moyenne des télomères.

La FISH quantitative des télomères a été réalisée à l'aide de sondes de télomères d'acide nucléique peptidique (PNA) marquées au Cy3 (tableau supplémentaire 1). Des coupes FFPE de cerveau ont été déparaffinées et déshydratées en série dans une série d'éthanol absolu (70/80/100%), suivies d'une récupération d'antigène dans un tampon de citrate de sodium (pH 6) à 90 ° C dans un bain-marie et refroidies à température ambiante. Les coupes ont été déshydratées dans une série d'alcools et dénaturées à 75°C pendant 6 min. Les sections ont ensuite été hybridées avec des sondes de télomères PNA pendant une nuit à 37 ° C. Les sondes non liées ont été lavées avec un tampon de citrate de sodium salin (SSC) 2X suivi de SSC 4X à 56 ° C pendant 3 minutes chacune. Les sections ont finalement été lavées dans un tampon de citrate de sodium salin 4X Tween-20 (SSCT) à température ambiante et montées dans VectaShield DAPI. Les images ont été acquises et analysées à l'aide du système Applied Spectral Bio-imaging (Applied Spectral Imaging, Israël). Des images d'environ 500 noyaux en interphase ont été acquises à l'aide du logiciel SpotScan 8.1 (https://spectral-imaging.com, Applied Spectral Imaging, Israël) en mode 3D multicanal avec une exposition constante de 1000 ms pour Cy3 (télomères) et 150 ms pour DAPI (noyaux) tout au long des expériences. Chaque image 3D est constituée d'un empilement de 11 plans focaux par cellule avec une distance d'échantillonnage de 500 nm dans la direction z et de 107 nm dans la direction xy. Les images ont été déconvoluées et le nombre de télomères par noyau a été estimé à l'aide de l'algorithme Spot Count du logiciel SpotView 8.1 (https://spectral-imaging.com, Applied Spectral Imaging, Israël). Le nombre d'agrégats de télomères par noyau a été estimé visuellement.

La détection du dépôt d'amyloïde dans le cerveau a été examinée par microscopie confocale sur des coupes FFPE après coloration immuno-fluorescente en utilisant un anticorps primaire contre la β-amyloïde et un anticorps secondaire approprié (tableau supplémentaire 1). Le BDNF sérique a été estimé par ELISA à l'aide d'un kit commercial (tableau supplémentaire 1) selon les instructions du fabricant.

L'expression de γ-H2AX, de la caspase-3 active et de NF-kB a été analysée sur des coupes FFPE de tissu cérébral par la méthode IF standard en utilisant des anticorps appropriés (tableau supplémentaire 1) comme nous l'avons décrit précédemment18,20.

L'évaluation des biomarqueurs de sénescence a été réalisée sur des coupes FFPE de tissu cérébral qui comprenaient : (1) la co-localisation des signaux télomères et γ-H2AX IF à l'aide d'Immuno-FISH ; (2) co-localisation des signaux IF de 53BP1 et de la leucémie pro-myélocytaire-corps nucléaires (PML-NB) ; (3) expression de p16INK4a par IF en utilisant des anticorps appropriés.

L'aneuploïdie a été évaluée par rapport aux numéros de chromosomes 7 et 16 par FISH en utilisant des sondes spécifiques aux chromosomes sur des coupes FFPE de tissus cérébraux. Les coupes ont été déparaffinées et déshydratées dans une série d'alcools (70 à 100%), suivies d'une récupération d'antigène dans un tampon de citrate de sodium (pH 6) à 90 ° C dans un bain-marie, puis refroidies à température ambiante. Les coupes ont été hybridées avec des sondes d'ADN spécifiques des chromosomes 7 et 16 pendant une nuit à 37 °C. Les sondes non liées ont été lavées avec 2X SSC suivi de 0,4X SSC à 70 ° C pendant 3 minutes chacune. Les sections ont finalement été lavées dans 4X SSCT et montées dans VectaShield DAPI. Les images ont été acquises et analysées à l'aide du système Applied Spectral Bio-imaging (Applied Spectral Imaging, Israël). Le nombre de signaux fluorescents par noyau a été compté et les signaux supérieurs ou inférieurs à 2 N ont été considérés comme une preuve d'aneuploïdie. Cinq champs contenant ~ 500 noyaux ont été analysés et le nombre moyen de signaux par noyau a été calculé.

Le dysfonctionnement mitochondrial a été analysé par IF sur des coupes FFPE de tissu cérébral pour évaluer l'expression de la protéine transmembranaire mitochondriale TOMM20. L'estimation des changements volumétriques dans l'expression de TOMM20 a été réalisée à l'aide du logiciel IMARIS 7.2.3 (http://www.bitplane.com, Bitplane Technologies, AG). Le volume moyen (dans les plans x–y–z) a été calculé pour 5 images (> 2 000 mitochondries) pour chaque coupe de cerveau.

Les taux sériques de glucose et de cholestérol ont été estimés à l'aide d'un instrument automatisé (Dimension EXL avec LM, Siemens). Les taux sériques de protéine C-réactive (CRP) ont été mesurés à l'aide d'un kit ELISA commercial (tableau supplémentaire 1) conformément au protocole du fabricant.

Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism 6.0 (https://www.graphpad.com/, GraphPad Software, Inc., États-Unis). Les résultats des souris témoins âgées ont été comparés à ceux des jeunes témoins et des souris âgées traitées au R – Cu. Les valeurs moyennes (± SEM) pour quatre souris de chaque groupe pour les deux sexes ont été comparées à l'aide du test t non paramétrique de Student non apparié, séparément pour les deux sexes.

L'étude a été approuvée par le Comité institutionnel d'éthique animale (IAEC) du Centre avancé de traitement, de recherche et d'éducation sur le cancer (ACTREC). ACTREC IAEC adhère aux directives ARRIVE. Les expériences de cette étude ont été menées conformément aux directives ARRIVE (tableau complémentaire 2).

Dans un premier temps, nous avons cherché à savoir si un traitement oral au R–Cu aurait pu conduire à la génération de radicaux libres dans le cerveau. Comme prévu, les souris vieillissantes ont montré une réduction significative des niveaux de SOD dans les cellules cérébrales (p <0, 05 et p <0, 01 chez les souris femelles et mâles, respectivement) (Fig. 1). Cependant, le traitement R – Cu a entraîné une augmentation marquée des niveaux de SOD, similaire à celle détectée chez les jeunes souris témoins (p <0, 01 chez les souris femelles et mâles) (Fig. 1). Cette découverte suggérait que des radicaux d'oxygène étaient apparemment générés in vivo après un traitement au R – Cu et qu'ils semblaient être entrés dans les cellules cérébrales. Ce dernier, dans une tentative d'éliminer les radicaux oxygène envahissants, avait activé un mécanisme de défense anti-oxydant en régulant à la hausse l'enzyme anti-oxydante SOD. Il convient de noter cependant que la méthode IF que nous avons utilisée pour détecter l'expression de la SOD dans les cellules cérébrales ne reflète pas son activité biologique. Cependant, le traitement R – Cu a entraîné une augmentation de l'activité SOD dans le sérum des souris vieillissantes, les restaurant à des niveaux similaires à ceux observés chez les jeunes souris témoins (p <0,01 et p <0,05 chez les souris femelles et mâles, respectivement) (Supplémentaire Figure S1). Sur la base de l'augmentation de l'activité SOD dans le sérum des souris traitées au R – Cu, on peut supposer que l'activité SOD a également augmenté dans les cellules cérébrales.

Perte d'activité SOD dans les cellules cérébrales de souris vieillissantes et sa restauration par traitement R – Cu. Images représentatives IF de l'expression de SOD dans les cellules cérébrales (panneau supérieur) (barre d'échelle = 10 µm) et quantification des niveaux de SOD exprimés sous forme d'histogrammes (panneau inférieur). Pour chaque lame, 1000 cellules ont été analysées et le pourcentage de cellules positives pour la SOD a été calculé. Les barres représentent les valeurs moyennes ± SEM. N = 4 animaux dans chaque groupe des deux sexes. Les valeurs des jeunes souris témoins et des souris vieillissantes traitées au R – Cu ont été comparées à celles des souris témoins vieillissantes, et une analyse statistique a été effectuée par le test t de Student à deux queues. *p < 0,05 ; **p < 0,01.

La microscopie confocale de coupes FFPE de cerveau de souris vieillissant a été réalisée après immuno-coloration fluorescente avec des anticorps anti-ADN (rouge) et anti-histone (vert). Lors de la superposition d'images fluorescentes d'ADN et d'histones, une présence abondante de cfChP (signaux fluorescents jaunes) a été détectée dans les espaces extracellulaires du cerveau de souris vieillissantes (Fig. 2). Les cfChP ont été pratiquement éliminés après un traitement R – Cu pendant un an. Cette découverte suggérait indirectement que les radicaux oxygène générés dans le cerveau de souris avaient apparemment désactivé/éradiqué la profusion de cfChP qui étaient présents dans les espaces extracellulaires du cerveau de souris vieillissant. Il convient de noter à partir de la figure 2 que tous les signaux fluorescents rouges (ADN) et verts (histone) n'étaient pas strictement co-localisés. Cela peut avoir résulté de l'irrégularité des surfaces coupées des sections FFPE qui ont empêché les anticorps respectifs d'accéder à l'ADN et aux épitopes d'histone sur les cfChP. La quantification de l'IMF des signaux cfChP fluorescents jaunes a montré une réduction remarquable des cfChP dans les espaces extracellulaires du cerveau vieillissant après un traitement d'un an avec R – Cu (p <0, 01 chez les deux sexes) (Fig. 2).

Présence abondante de cfChPs dans les espaces extracellulaires du cerveau vieillissant et leur désactivation/éradication par le traitement R–Cu. Images confocales représentatives des sections FFPE après immuno-coloration fluorescente avec des anticorps anti-ADN (rouge) et anti-histone, montrant la co-localisation des signaux rouges et verts pour générer des particules de couleur jaune/blanche qui représentent les cfChP (panneau de gauche). Quantification des signaux IF jaunes exprimés sous forme d'histogrammes (panneau de droite). L'intensité de fluorescence de cinq champs confocaux choisis au hasard (~ 50 cellules dans chaque champ) de chaque section a été enregistrée. Les barres représentent les valeurs moyennes ± SEM. N = 4 animaux dans chaque groupe des deux sexes. Les valeurs des jeunes souris témoins et des souris vieillissantes traitées au R – Cu ont été comparées à celles des souris témoins vieillissantes, et une analyse statistique a été effectuée par le test t de Student à deux queues. **p < 0,01, ***p < 0,001.

Les télomères jouent un rôle central dans les changements cellulaires associés au vieillissement32. L'attrition des télomères, la perte de télomères et l'agrégation des télomères sont des caractéristiques cardinales du vieillissement32,33. Nous avons estimé la longueur des télomères dans les cellules cérébrales par qRT-PCR et observé une réduction significative de la longueur des télomères chez les souris des deux sexes (p <0, 0001 et p <0, 01 chez les souris femelles et mâles, respectivement) (Fig. 3A). Le traitement R – Cu a restauré la longueur des télomères à un degré significatif chez les souris femelles (p <0, 001), mais pas chez les souris mâles (Fig. 3A). En ce qui concerne le nombre de signaux de télomères par cellule cérébrale, une réduction a été observée chez les souris vieillissantes des deux sexes (p < 0,01 chez les deux sexes), qui a de nouveau été restaurée de manière significative après un traitement R – Cu chez la femelle (p < 0,01) mais pas chez la souris. souris mâles (Fig. 3B, C). Une observation similaire a été faite en ce qui concerne l'agrégation des télomères, qui a été significativement augmentée chez les souris vieillissantes des deux sexes (p < 0,001 et p < 0,01 chez les souris femelles et mâles, respectivement), mais a été significativement réduite après le traitement R – Cu uniquement chez souris femelles (p < 0,01) (Fig. 3B,D). Ainsi, dans l'ensemble, en ce qui concerne les anomalies des télomères, R – Cu s'est avéré efficace pour restaurer les anomalies des télomères chez les souris femelles mais pas chez les souris mâles.

Anomalies des télomères dans les cellules cérébrales de souris vieillissantes et leur prévention par un traitement au R–Cu. (A) Estimation de la longueur des télomères par RT-PCR quantitative. Les barres représentent les valeurs moyennes ± SEM. N = 4 animaux des deux sexes, sauf chez les souris femelles traitées au R–Cu où N était = 3 ; (B) Images représentatives des télomères FISH (barre d'échelle = 10 µm). (C) Histogrammes représentant le nombre de télomères par noyau estimé par SpotScan Software 8.1 (https://spectral-imaging.com, Applied Spectral Imaging, Israël). Le nombre moyen de signaux de télomères fluorescents par noyau à partir de cinq champs choisis au hasard (~ 500 noyaux) est représenté dans les histogrammes. Les barres représentent les valeurs moyennes ± SEM. N = 4 animaux chaque groupe des deux sexes ; (D) Histogrammes représentant les agrégats de télomères par noyau (marqués par des têtes de flèches en B). Le nombre moyen d'agrégats de télomères fluorescents par noyau de cinq champs choisis au hasard (~ 500 noyaux) est représenté dans les histogrammes. Les barres représentent les valeurs moyennes ± SEM. N = 4 animaux par groupe des deux sexes. Les valeurs de In (A, C, D) chez les jeunes témoins et les souris vieillissantes traitées au R – Cu ont été comparées à celles des témoins vieillissants, et l'analyse statistique a été effectuée par le test t de Student bilatéral. **p < 0,01 ; ***p < 0,001 ; ****p < 0,0001.

L'augmentation du dépôt de protéine amyloïde (Aβ) dans les espaces extracellulaires des cellules cérébrales est classiquement associée à la maladie d'Alzheimer34,35. La microscopie confocale utilisant un anticorps contre la β-amyloïde a détecté une augmentation marquée du dépôt d'amyloïde sous la forme de fibrilles amyloïdes chez des souris vieillissantes. Ce dernier a été remarquablement réduit après un an de traitement R – Cu (Fig. 4A, panneau de gauche). La quantification du MFI a confirmé l'augmentation marquée du dépôt extracellulaire de β-amyloïde dans le cerveau des souris vieillissantes (p < 0,0001 et p < 0,01 chez les souris femelles et mâles, respectivement). Un an de traitement au R – Cu a entraîné une réduction significative de l'amyloïde extracellulaire chez les souris des deux sexes (p <0, 01 et p <0, 5 chez les souris femelles et mâles, respectivement) (Fig. 4A, panneau de droite).

Augmentation du dépôt de β-amyloïde dans le cerveau vieillissant et réduction du BDNF dans le sérum, qui sont tous deux inversés par un traitement au R – Cu. (A) Images confocales représentatives du dépôt de β-amyloïde dans le cerveau tel que détecté par IF (panneau de gauche). Histogrammes quantitatifs représentant les valeurs MFI moyennes (± SEM) de la fluorescence β-amyloïde (panneau de droite). Pour chaque lame, la zone cérébrale couverte par 1000 cellules a été analysée. N = 4 animaux dans chaque groupe des deux sexes. (B) Histogrammes quantitatifs représentant les taux sériques moyens de BDNF (± SEM). N = 4 animaux dans chaque groupe des deux sexes, à l'exception des jeunes femelles témoins (N = 3), des femelles vieillissantes traitées au R – Cu (N = 3) et des souris mâles témoins vieillissantes (N = 3). Dans (A) et (B), les valeurs des jeunes témoins et des animaux vieillissants traités au R – Cu ont été comparées à celles des témoins vieillissants, et une analyse statistique a été effectuée par le test t de Student bilatéral. *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001 ; ****p < 0,0001.

Le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF), qui joue un rôle important dans la survie et la croissance neuronales36, a été fortement réduit dans le sérum de souris vieillissantes des deux sexes, tel que mesuré par ELISA (p < 0,01 et p < 0,05 chez les souris femelles et mâles, respectivement) (Fig. 4B). Le traitement au R – Cu pendant un an a ramené les taux sériques de BDNF presque à ceux observés chez les jeunes souris des deux sexes (p <0, 05 et p <0, 001 chez les souris femelles et mâles, respectivement) (Fig. 4B).

Nous avons ensuite examiné plusieurs autres caractéristiques du vieillissement, à savoir. Dommages à l'ADN, apoptose et inflammation des cellules cérébrales37,38,39. Les dommages à l'ADN ont été examinés en utilisant la phosphorylation de H2AX comme marqueur des cassures de l'ADNdb40. Les niveaux de γ-H2AX ont été nettement augmentés chez les souris vieillissantes (p < 0,001 et p < 0,0001 chez les souris femelles et mâles, respectivement). Le traitement R – Cu a réduit les niveaux de γ-H2AX (p <0, 01 et p <0, 05 chez les souris femelles et mâles, respectivement) (Fig. 5A, panneaux de gauche et de droite).

Dommages à l'ADN, apoptose et inflammation dans les cellules cérébrales de souris vieillissantes et leur prévention par un traitement au R – Cu. (A) Images représentatives de l'expression γH2AX (barre d'échelle = 10 µm) (panneau de gauche). Histogrammes quantitatifs (panneau de droite). Pour chaque lame, 1000 cellules ont été analysées et le pourcentage de cellules positives pour γH2AX a été calculé. Les barres représentent les valeurs moyennes ± SEM. N = 4 animaux dans chaque groupe des deux sexes. (B) Images représentatives de l'expression active de la caspase 3 (barre d'échelle = 10 µm) (panneau de gauche). Histogrammes quantitatifs (panneau de droite). Pour chaque lame, 1000 cellules ont été analysées et le pourcentage de cellules positives pour la caspase-3 a été calculé. Les barres représentent les valeurs moyennes ± SEM. N = 4 animaux dans chaque groupe des deux sexes. (C) Images représentatives de l'expression de NF-kB (barre d'échelle = 10 µm) (panneau de gauche). Histogrammes quantitatifs (panneau de droite). Pour chaque lame, 1000 cellules ont été analysées et le pourcentage de cellules positives pour NF-kB a été calculé. Les barres représentent les valeurs moyennes ± SEM. N = 4 animaux dans chaque groupe des deux sexes. Pour (A – C), les niveaux chez les jeunes témoins et les animaux vieillissants traités au R – Cu ont été comparés à ceux des témoins vieillissants, et l'analyse statistique a été effectuée par le test t de Student bilatéral. *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001 ; ****p < 0,0001.

Nous avons ensuite examiné les niveaux actifs de caspase-3, qui est connu pour être un marqueur de l'apoptose médiée par les mitochondries41. Une augmentation hautement significative de l'apoptose dans les cellules cérébrales vieillissantes a été observée chez les deux sexes (p < 0,0001). Le traitement R – Cu a réduit de manière significative le degré d'apoptose chez les souris des deux sexes (p <0, 01 et p <0, 0001 chez les souris femelles et mâles, respectivement) (Fig. 5B, panneaux de gauche et de droite).

L'inflammation est une caractéristique cardinale du vieillissement12, et nous avons évalué l'expression du facteur de transcription NF-kB dans les cellules cérébrales. Ce dernier était très significativement élevé chez les souris vieillissantes des deux sexes (p < 0,0001). Le traitement R – Cu a réduit de manière significative les niveaux de NF-kB chez les deux sexes (p <0, 05 et p <0, 01 chez les souris femelles et mâles, respectivement) (Fig. 5C, panneaux de gauche et de droite).

La sénescence est la marque du vieillissement biologique caractérisé par une détérioration progressive des fonctions cellulaires42. Nous avons observé la persistance de nombreux signaux co-localisants de γ-H2AX avec ceux des télomères (DNA-SCARS) - une caractéristique classique de la sénescence43 - chez les souris vieillissantes des deux sexes (p < 0,001). La quantification des signaux de co-localisation a révélé une réduction marquée après le traitement R – Cu (p <0, 01 chez les deux sexes) (Fig. 6A, panneaux supérieur et inférieur).

Activation des caractéristiques de la sénescence dans les cellules cérébrales de souris vieillissantes et leur prévention par un traitement au R – Cu. (A) Images immuno-FISH représentatives montrant la co-localisation des signaux fluorescents de γ-H2AX et des télomères (panneau supérieur) (barre d'échelle = 10 µm). Histogrammes d'estimation quantitative de signaux co-localisés (panneau inférieur). Pour chaque lame, 500 noyaux ont été analysés et le pourcentage de cellules présentant une co-localisation des signaux γH2AX et des télomères a été calculé. Les barres représentent les valeurs moyennes ± SEM. N = 4 animaux dans chaque groupe des deux sexes. (B) Images représentatives IF montrant la co-localisation des signaux fluorescents de 53BP1 et PML (panneau de gauche) (barre d'échelle = 10 µm). Histogrammes d'estimation quantitative de signaux co-localisés (panneau de droite). Pour chaque lame, 500 noyaux ont été analysés et le pourcentage de cellules présentant une co-localisation des signaux 53BP1 et PML a été calculé. Les barres représentent les valeurs moyennes ± SEM. N = 4 animaux dans chaque groupe des deux sexes. (C) Images représentatives de l'expression de p16 (panneau supérieur) (barre d'échelle = 10 µm) et histogrammes quantitatifs (panneau inférieur). Pour chaque lame, 1000 cellules ont été analysées et le pourcentage de cellules positives pour p16 a été calculé. Les barres représentent les valeurs moyennes ± SEM. N = 4 animaux dans chaque groupe des deux sexes. Dans (A–C), les valeurs des jeunes témoins et des animaux vieillissants traités au R–Cu ont été comparées à celles des témoins vieillissants, et l'analyse statistique a été effectuée par le test t de Student bilatéral. *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001 ; ****p < 0,0001.

Les cassures d'ADN double brin forment un hub de stockage pour plusieurs protéines de liaison à l'hétérochromatine sous la forme de foyers hétérochromatiques associés à la sénescence (SAHF)44. L'une de ces protéines de liaison à l'hétérochromatine est la leucémie pro-myélocytaire des corps nucléaires (PML-NB), qui s'est avérée significativement corrélée à la sénescence associée aux dommages à l'ADN chez les souris vieillissantes45,46. Nous montrons que le nombre de signaux de co-localisation de 53BP1 et PML a été nettement augmenté chez les souris vieillissantes des deux sexes (p < 0,0001). Les signaux de co-localisation ont été significativement réduits après un traitement au R – Cu pendant 1 an (p <0, 05 et p <0, 01 chez les souris femelles et mâles, respectivement) (Fig. 6B, panneaux de gauche et de droite).

Un autre marqueur de sénescence que nous avons examiné était p16 INK4a 47, qui était élevé chez les souris vieillissantes des deux sexes (p < 0,0001 pour les deux sexes). Le traitement R – Cu a réduit de manière significative les niveaux de p16 INK4a (p <0, 05 et p <0, 01 chez les souris femelles et mâles, respectivement) (Fig. 6C, panneaux supérieur et inférieur).

La perte de télomères entraînant la fusion des chromosomes chez les souris vieillissantes peut provoquer une aneuploïdie entraînant un nombre anormal de chromosomes48. Nous avons examiné le degré d'aneuploïdie dans les cellules cérébrales par rapport aux chromosomes n° 7 et 16 et observé une augmentation d'environ 15 fois de l'aneuploïdie chez les souris vieillissantes par rapport aux deux chromosomes (p < 0,0001 pour les deux chromosomes chez les deux sexes) (Fig. 7 , panneaux de gauche et de droite). Le traitement R – Cu a nettement réduit l'aneuploïdie en ce qui concerne les deux chromosomes chez les deux sexes (p <0, 001)) (Fig. 7, panneaux de gauche et de droite).

Développement de l'aneuploïdie dans les cellules cérébrales de souris vieillissantes et sa prévention par un traitement au R–Cu. Images représentatives de l'aneuploïdie du chromosome 7 et du chromosome 16 dans les cellules cérébrales (panneaux de gauche) (barre d'échelle = 10 µm). Histogrammes quantitatifs représentant le pourcentage de cellules aneuploïdes (panneaux de droite). Le nombre de signaux fluorescents par noyau a été compté et les signaux inférieurs à 2 N ou supérieurs à 2 N dans un noyau ont été pris comme preuve d'aneuploïdie. Cinq champs (~ 500 noyaux) ont été analysés et le nombre moyen de signaux par noyau a été calculé. Les barres représentent les valeurs moyennes ± SEM. N = 4 animaux dans chaque groupe des deux sexes. Les valeurs des jeunes témoins et des animaux vieillissants traités au R–Cu ont été comparées à celles des témoins vieillissants, et une analyse statistique a été effectuée par le test t de Student bilatéral. ***p < 0,001 ; ****p < 0,0001.

L'intégrité et la fonctionnalité de l'ADN mitochondrial diminuent avec l'âge, ce qui entraîne une accumulation de dommages oxydatifs causés par les espèces réactives de l'oxygène (ROS)49. Nous avons étudié le dysfonctionnement mitochondrial en analysant l'expression de TOMM20, une sous-unité codée au niveau nucléaire du complexe de translocation mitochondriale qui importe d'autres protéines codées au niveau nucléaire. Sa surexpression favoriserait la neurodégénérescence50. Nos résultats ont révélé une surexpression de TOMM20 sur la membrane mitochondriale entraînant une augmentation du volume mitochondrial total dans les cellules cérébrales vieillissantes par rapport aux jeunes témoins (p <0,001 chez les deux sexes). Le traitement R – Cu a restauré de manière significative le volume mitochondrial (p <0, 05 et p <0, 01 chez les souris femelles et mâles, respectivement) (Fig. 8, panneaux supérieur et inférieur).

Augmentation du dysfonctionnement mitochondrial chez les souris vieillissantes et sa prévention par un traitement au R – Cu. Images représentatives IF montrant l'expression de TOMM20 (panneau supérieur) (barre d'échelle = 10 µm). Histogrammes quantitatifs représentant les changements de volume mitochondrial (panneau inférieur). Cinq champs (~ 2000 mitochondries) ont été analysés et le changement volumétrique moyen a été estimé à l'aide du logiciel IMARIS 7.2.3 (http://www.bitplane.com, Bitplane Technologies, AG). Les barres représentent les valeurs moyennes ± SEM. N = 4 animaux dans chaque groupe des deux sexes. Les valeurs des jeunes témoins et des animaux vieillissants traités au R–Cu ont été comparées à celles des témoins vieillissants, et une analyse statistique a été effectuée par le test t de Student bilatéral. *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001.

Le vieillissement métabolique implique une dérégulation des processus physiologiques conduisant à une résistance à l'insuline et à une accumulation de lipides provoquée par une inflammation chronique de bas grade51,52. Comme prévu, les niveaux de glucose sérique étaient significativement élevés chez les souris vieillissantes53 (p < 0,01 pour les deux sexes), qui ont été réduits aux niveaux observés chez les jeunes témoins après un traitement d'un an avec R – Cu (p < 0,01 pour les deux sexes) (Fig. 9A ). Le cholestérol sérique était significativement élevé chez les souris femelles vieillissantes (p <0, 05), mais pas chez les souris mâles (figure 9B). Le cholestérol sérique était significativement élevé chez les souris femelles vieillissantes (p <0, 05), mais pas chez les souris mâles (figure 9B). Néanmoins, le traitement au R–Cu a réduit de manière significative les taux de cholestérol sérique chez les deux sexes (p < 0,001 et p < 0,05 chez les souris femelles et mâles, respectivement). La CRP était très significativement élevée chez les souris vieillissantes des deux sexes (p <0, 0001) et a été réduite par le traitement R – Cu (p <0, 05 chez les deux sexes) (Fig. 9C).

Augmentation du dysfonctionnement métabolique chez les souris vieillissantes et leur prévention par un traitement au R–Cu. (A–C) représentent les histogrammes des taux sériques de glucose, de cholestérol et de CRP, respectivement. Les barres représentent les valeurs moyennes ± SEM. N = 4 animaux dans chaque groupe des deux sexes sauf chez les jeunes femelles témoins cholestérol (N = 3) et les jeunes mâles témoins cholestérol (N = 2). Les niveaux chez les jeunes témoins et les animaux vieillissants traités au R–Cu ont été comparés à ceux des témoins vieillissants, et l'analyse statistique a été effectuée par le test t de Student bilatéral. *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001 ; ****p < 0,0001.

Les ROS sont des espèces moléculaires à courte durée de vie contenant un électron non apparié, ce qui les rend hautement réactifs lorsqu'ils recherchent un autre électron avec lequel s'apparier et, ce faisant, ils peuvent endommager des biomolécules telles que l'ADN, les protéines et les lipides54. Le stress oxydatif induit par les ROS est connu pour avoir de multiples effets délétères sur les cellules hôtes55. Cependant, nous avons rapporté que, paradoxalement, lorsque les ROS sont générés artificiellement à l'extérieur de la cellule dans les espaces extracellulaires du corps, ils peuvent avoir des effets thérapeutiques de grande envergure18,19,20,26,27. Le mélange de R avec Cu conduit à la génération de radicaux oxygène en raison de la capacité de R à réduire Cu (II) en Cu (I)23,25. Les radicaux oxygène générés dans l'estomac lors de l'administration orale de R – Cu sont apparemment absorbés pour avoir des effets systémiques sous la forme de désactivation / éradication des cfChP extracellulaires. Nous avons montré que les cfChP ont des effets néfastes de grande envergure sur les cellules hôtes. Par exemple, les cfChP peuvent facilement pénétrer dans les cellules saines pour endommager leur ADN, activer les cytokines inflammatoires et favoriser l'apoptose via la voie mitochondriale13,14. Étant donné que 1 × 109–1 × 1012 cellules meurent dans le corps chaque jour56,57, nous avons émis l'hypothèse que l'agression répétée et permanente des cellules saines par les cfChP dérivés des cellules mourantes pourrait être la cause sous-jacente du vieillissement15,16. À l'appui de cette hypothèse, nous montrons dans cet article qu'une administration orale prolongée de R – Cu à des souris vieillissantes a régulé à la baisse plusieurs caractéristiques biologiques du vieillissement et de la neurodégénérescence en raison de sa capacité à désactiver les cfChP. Nos résultats suggèrent que le R–Cu pourrait être considéré comme un agent anti-âge idéal car il a le potentiel de simultanément retarder ou retarder les nombreuses conditions associées au vieillissement2. Pour être applicable à l'échelle mondiale, un agent anti-âge idéal doit également être peu coûteux et non toxique, les deux critères auxquels répond également le R–Cu. Ce dernier peut être facilement administré par voie orale, et R et Cu sont déjà approuvés pour un usage humain. Un résumé illustré de la conception de l'étude et des mécanismes par lesquels les radicaux d'oxygène générés par R – Cu éradiquent les cfChP du micro-environnement cérébral, entraînant une régulation à la baisse des caractéristiques du vieillissement, est fourni à la Fig. 10.

Illustration graphique de la conception de l'étude et des mécanismes impliqués dans la régulation à la baisse induite par les radicaux oxygène des caractéristiques biologiques du vieillissement dans les cellules cérébrales après un traitement au R – Cu. (A) Les cfChP qui diffusent hors de la circulation, ou ceux qui sont libérés localement par les cellules cérébrales mourantes, sont facilement intériorisés par les cellules cérébrales saines, où ils activent plusieurs caractéristiques biologiques du vieillissement. (B) Des radicaux d'oxygène sont générés dans l'estomac lors de l'administration orale de R – Cu qui sont facilement absorbés, entraînant des effets systémiques sous la forme de désactivation/éradication des cfChP dans le micro-environnement cérébral. La désactivation/éradication des cfChP conduit à une régulation à la baisse des caractéristiques biologiques du vieillissement dans les cellules cérébrales. Les radicaux d'oxygène pénètrent également dans les cellules cérébrales saines; mais leur entrée conduit à l'activation de l'enzyme anti-oxydante superoxyde dismutase (SOD), qui détoxifie et élimine les agents incriminés, protégeant ainsi l'ADN génomique.

Le ou les mécanismes par lesquels R – Cu régule à la baisse les multiples caractéristiques biologiques du vieillissement et de la neurodégénérescence doivent être élaborés. L'inversion du raccourcissement des télomères par R – Cu peut suggérer que le raccourcissement des télomères pourrait être une conséquence des dommages à l'ADN infligés par les cfChP qui coupent les extrémités des télomères et les raccourcissent. Nous avons observé des effets différentiels entre les souris femelles et mâles en ce qui concerne les anomalies des télomères. Les effets R – Cu dans la prévention des anomalies des télomères chez les souris femelles étaient statistiquement significatifs pour tous les paramètres testés, alors que ce n'était pas le cas chez les souris mâles. L'explication biologique de ce résultat discordant reste à déterminer. La rupture des extrémités des télomères peut également aider à expliquer notre détection de signaux γ-H2AX persistants dans les régions des télomères des cellules cérébrales (DNA-SCARS) - une signature établie de la sénescence43. Les extrémités chromosomiques nues peuvent fusionner les unes avec les autres pour entraîner une instabilité chromosomique et une aneuploïdie48, comme cela a été détecté dans notre étude. En ce qui concerne le dysfonctionnement mitochondrial, nous avons récemment signalé que les cfChP internalisés, en plus d'infliger des dommages à l'ADN génomique, peuvent infliger des dommages physiques aux mitochondries58. L'un des indicateurs de dommages mitochondriaux détectés dans cette étude était la régulation à la hausse de TOMM2058. Notre découverte dans la présente étude de la surexpression de TOMM20 chez les souris vieillissantes et de son inversion par R – Cu est cohérente avec la possibilité que des dommages mitochondriaux chez les souris vieillissantes soient induits par les cfChP libérés par les cellules cérébrales mourantes. Cependant, la réduction de la formation de plaques amyloïdes après un traitement prolongé au R – Cu suggérerait un rôle inconnu des cfChP qui nécessite des recherches supplémentaires. De même, le ou les mécanismes par lesquels R – Cu réduit le dysfonctionnement métabolique chez les souris vieillissantes entraînant une réduction des taux sériques de glucose, de cholestérol et de CRP restent inconnus à l'heure actuelle. Pris ensemble, on peut conclure que les cfChP ont des effets pléiotropes avec des implications étendues dans le vieillissement et la neurodégénérescence qui restent ouvertes à la recherche future.

Nous n'avons détecté aucune preuve de dommages à l'ADN génomique des cellules cérébrales qui pourraient être attribués aux radicaux oxygène générés après un an de traitement au R–Cu. L'enzyme antioxydante nettement régulée à la hausse SOD chez les souris traitées au R – Cu a apparemment neutralisé les radicaux d'oxygène envahissants et empêché les dommages à l'ADN génomique cellulaire (voir Fig. 1). Ainsi, l'entrée de radicaux oxygène générés par R – Cu dans les cellules cérébrales conduit à une régulation à la hausse de la SOD, qui à son tour a protégé le génome des dommages oxydatifs induits par les ROS. Cela a été étayé par notre découverte d'une réduction des signaux γ-H2AX chez les souris traitées après R – Cu (voir Fig. 5A). Dans l'ensemble, nous n'avons observé aucun effet indésirable chez les souris ayant reçu du R–Cu pendant une période d'un an. Cela suggérait que les génomes de toutes les cellules du corps étaient protégés de la même manière des effets potentiellement nocifs des radicaux oxygène par des enzymes antioxydantes régulées à la hausse.

Notre étude comporte certaines limites. Par exemple, il n'aborde pas les effets du R–Cu sur les fonctions physiologiques telles que la mémoire ou les aspects comportementaux des animaux, ni s'il prolonge la survie. Les effets de l'arrêt de l'exposition au R–Cu n'ont pas non plus été étudiés ; on ne sait pas si les changements observés reviendraient ou disparaîtraient. L'étude n'aborde pas non plus si le phénomène d'hormèse est impliqué dans les effets biologiques que nous avons observés59,60. Cette question est particulièrement pertinente puisque nous avons utilisé de faibles doses de R et de Cu, qui ont toutes deux été signalées comme ayant des effets hormétiques61,62. Il a été rapporté que la réponse réussie à la thérapie R est due à ses actions hormétiques : effets bénéfiques à faibles doses et effets cytotoxiques à doses plus élevées61. En ce qui concerne le Cu, il a été démontré qu'un traitement préalable des animaux avec de faibles doses les protège contre des doses létales plus élevées de Cu62. Nous ne fournissons pas de preuve directe que le mélange de R avec Cu conduit à la génération de radicaux oxygène en raison de la capacité de R à réduire Cu(II) en Cu(I). La désactivation des cfChP dans les espaces extracellulaires du cerveau que nous avons observée suppose que cela est effectué par des radicaux oxygène ; nous ne démontrons pas réellement la présence de radicaux oxygène dans le cerveau de souris. Cependant, notre découverte d'une activité SOD accrue dans le sérum de souris traitées au R – Cu conduit à l'hypothèse que des radicaux oxygène pourraient également avoir été générés dans le cerveau. Nous n'avons pas non plus examiné le mécanisme par lequel les radicaux oxygène sont absorbés par l'estomac ou s'ils étaient réactifs contre les cfChP. Enfin, nous avons observé que le traitement R – Cu conduit à une augmentation de l'expression de la SOD dans les cellules cérébrales. Cela n'implique pas nécessairement une activité SOD accrue.

On pense que le vieillissement est une conséquence du stress oxydatif entraînant une perte progressive de la fonction des tissus et des organes résultant de l'accumulation de dommages induits par les ERO63,64. Cependant, la thérapie antioxydante pour retarder le vieillissement chez les modèles animaux a produit des résultats contradictoires65,66, et ceux chez l'homme ont été équivoques67. De tous les antioxydants, le resvératrol a été le plus largement étudié en tant qu'agent anti-âge68. Nos résultats actuels soulèvent l'hypothèse que les effets anti-âge rapportés du resvératrol pourraient en fait être dus à son activité pro-oxydante en présence de cuivre. Les résultats contradictoires peuvent refléter la disponibilité irrégulière du cuivre dans l'estomac pour que le resvératrol ait une activité pro-oxydante soutenue afin de désactiver efficacement les cfChPs extracellulaires et d'avoir un effet protecteur contre le vieillissement.

Nous démontrons pour la première fois que les cfChP dérivés de cellules cérébrales mourantes sont abondamment présents dans les espaces extracellulaires du cerveau vieillissant. Nous montrons également que les cfChP extracellulaires sont pratiquement éliminés par les radicaux oxygène générés après un traitement prolongé avec R – Cu. Le fait que l'élimination des cfChP était associée à une régulation à la baisse de plusieurs caractéristiques biologiques du vieillissement et de la neurodégénérescence plaide en faveur d'un rôle direct des cfChP dans l'étiologie de ces processus pathologiques. Nous proposons que les cfChP libérés par les cellules cérébrales mourantes initient un cercle vicieux de dommages à l'ADN, d'apoptose et d'inflammation, déclenchant une "tempête de cytokines" de faible intensité et incessante69. Nous proposons que ces derniers, ainsi que d'autres effets pléiotropiques nocifs encore inconnus des cfChP, sont les processus sous-jacents qui définissent le vieillissement. Nos résultats suggèrent que ces effets nocifs peuvent être prévenus par la désactivation/éradication des cfChPs incriminés via le milieu des radicaux oxygène. Nous proposons que l'administration orale d'une combinaison de petites quantités de R et Cu tient la promesse d'être une combinaison thérapeutique anti-âge efficace. Pour savoir si R–Cu sera efficace pour retarder le vieillissement et la neurodégénérescence chez l'homme, il faudra attendre des essais cliniques dans des populations appropriées. Il convient de noter dans ce contexte que nos premiers résultats ont montré que le R–Cu est thérapeutiquement efficace chez l'homme, bien que par rapport à d'autres situations pathologiques26,27.

Au cours des cinquante dernières années de recherche biogérontologique, de nombreuses théories et causes du vieillissement ont été avancées9,10, mais aucune ne peut expliquer de manière exhaustive la myriade de changements qui accompagnent ce processus multidimensionnel. Bien que nous reconnaissions qu'il peut y avoir d'autres facteurs en jeu, nos résultats suggèrent que les cfChP peuvent être des instigateurs mondiaux du vieillissement et de la neurodégénérescence, et que l'utilisation thérapeutique du R-Cu peut aider à faire du vieillissement en bonne santé un objectif réalisable.

Toutes les données pertinentes à l'interprétation des résultats sont contenues dans le manuscrit. Les données brutes peuvent être trouvées dans le référentiel d'ensembles de données Figshare (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.20265906).

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Nous remercions sincèrement le Dr Snehal Shabrish pour la préparation de l'infographie et M. Roshan Shaikh et M. Ashish Pawar pour leur aide dans la préparation du manuscrit.

Cette étude a été soutenue par le Département de l'énergie atomique du gouvernement indien, par le biais de sa subvention CTCTMC au Tata Memorial Center accordée à IM. L'agence de financement n'a joué aucun rôle dans la conception de la recherche, la collecte, l'analyse et l'interprétation des données et la rédaction du manuscrit.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Kavita Pal et Gorantla V. Raghuram.

Laboratoire de recherche translationnelle, Tata Memorial Centre, Centre avancé de traitement, de recherche et d'éducation sur le cancer, Kharghar, Navi Mumbai, 410210, Inde

Kavita Pal, Gorantla V. Raghuram, Jenevieve Dsouza, Sushma Shinde, Vishalkumar Jadhav, Alfina Shaikh, Bhagyeshri Rane, Harshali Tandel, Dipali Kondhalkar, Shahid Chaudhary & Indraneel Mittra

Institut national Homi Bhabha, Anushakti Nagar, Mumbai, 400094, Inde

Kavita Pal, Gorantla V. Raghuram, Jenevieve Dsouza, Sushma Shinde, Vishalkumar Jadhav, Alfina Shaikh, Bhagyeshri Rane, Harshali Tandel, Dipali Kondhalkar, Shahid Chaudhary & Indraneel Mittra

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KP, GVR, JD, SS, VJ, AS, BR, HT, DK et SC ont mené l'expérience. IM, KP et GVR ont supervisé les expériences. KP et GVR ont procédé à l'analyse des données. IM a conceptualisé le projet, était responsable de la supervision globale et a obtenu le financement. IM, KP et GVR ont rédigé l'article. IM a approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Indraneel Mittra.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Pal, K., Raghuram, GV, Dsouza, J. et al. Une combinaison pro-oxydante de resvératrol et de cuivre régule à la baisse plusieurs caractéristiques biologiques du vieillissement et de la neurodégénérescence chez la souris. Sci Rep 12, 17209 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21388-w

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Reçu : 30 juin 2022

Accepté : 27 septembre 2022

Publié: 14 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-21388-w

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